不同产地桑叶药材UPLC指纹图谱研究

彭丽英+彭攸灵+杨先国

[摘要] 目的 建立不同产地桑叶UPLC指纹图谱。 方法 采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）色谱柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长为358 nm，流速为0.6 ml/min，柱温40℃，进样体积1 μl。 结果 建立了桑叶专属性的UPLC指纹图谱，确定了15个共有峰，不同产地桑叶样品具有较好的相似度。结论 UPLC指纹图谱方法重复性好，简便可靠，可用于桑叶的快速鉴别，可以为桑叶的质量控制和市场应用提供依据。

[关键词] 桑叶；指纹图谱；超高效液相色谱法

[中图分类号] R286[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（b）-0008-04

Study on UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions

PENG Li-ying PENG You-ling YANG Xian-guo▲

Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou412012,China

[Abstract] Objective To establish UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions. Methods Column ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50.0 mm,1.7 μm)was used.The mobile phase was methanol-0.2％ phosphoric acid water with gradient elution.The detection wave-lengths was 358 nm and column temperature was 40℃ with the flow rate of 0.6 ml/min.The sample injection was 1 μl. Results A specificity fingerprint chromatogram was produced and 15 characteristic peaks were designated.The results showed that the collected samples had a good similarity. Conclusion UPLC fingerprint is a reliable,available and quick method of quality control of Morus alba L. and it is necessary for the safe and practicable use of the medicine.

[Key words] Morus alba L.;Fingerprint;UPLC

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除去杂质，晒干，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，主要用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花[1]。桑叶药食两用，现代研究表明桑叶具有降血糖[2-4]、降血压[5]、降血脂、抗炎、抗衰老[6]、抗肿瘤[7]等功效，在药用和食品保健方面都发挥了重要作用。目前，桑叶的质量控制主要集中于芦丁和绿原酸含量的测定[8-12]，除芦丁外，其他黄酮类化合物也是桑叶质量控制的热点[13-16]。随着国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，桑叶的质量也参差不齐。课题组认为中药是多成分、多环节、多靶点的药物，质量控制也需要体现中药特色，仅靠单一或几个指标难以衡量质量的优劣。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，符合中医中药整体性和模糊性的特点[17]。课题组为了进一步控制桑叶质量，采用UPLC方法，对从全国收集的桑叶药材进行指纹图谱进行研究。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；JA51002型电子分析天平（岛津）；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters公司）。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为娃哈哈纯净水，磷酸（色谱纯，北京化工厂）。

1.3 对照品及药材

对照品异槲皮苷和紫云英苷，购于成都植标化纯生物技术有限公司，供含量测定用，批号分别为PCS0371-lot 120510和PCS0468-lot 120328；对照品芦丁购于中国食品药品检定研究院，批号为0080-9705。不同产地的桑叶药材11批，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，药材批号及来源见表1。

表1 桑叶药材批号及来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流速：0.6 ml/min；检测波长：358 nm；柱温：40℃；进样体积：1 μl；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：0→22 min，10%A→32%A。

2.2 供试品溶液的制备

药材粉碎，过60目筛，取药粉约0.5 g，精密称定，置于100 ml三角瓶中，加入75%甲醇50 ml，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品异槲皮苷、芦丁和紫云英苷适量，用75%甲醇溶解，定容，得到其浓度分别为0.092、0.042、0.054 μg/μl。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验取同一批桑叶供试品（20080305），按照2.2项的方法制备供试品溶液1份，按照上述色谱条件，连续进样6次，测定指纹图谱。以10号峰（图1）的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，相对峰面积的RSD＜1.0％，表明仪器的精密度良好。

图1 桑叶药材共有模式指纹图谱

2.4.2 重复性试验按上述方法平行制备同一批桑叶供试品（20080305），测定指纹图谱。考察样品中所含有15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.5%，相对峰面积的RSD＜1.0％，提示方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验同一批桑叶供试品（20080305）溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，以各峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察，桑叶样品24 h各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，相对峰面积的RSD＜1.0％，表明桑叶样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批，按照2.2下方法制备供试品溶液，分别进样1 μl，记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2.0版）进行分析，生成共有模式指纹图谱，有15个共有峰（图1），其中以峰10（S峰）为参照物，其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。

2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件，得共有指纹图谱（图2），对照品溶液的色谱图见图3，经与对照品对照，指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上数据表明桑叶各批次相似性较好。

3 讨论

本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究，与HPLC相比，UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内，更加快捷和节约溶剂。

本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物，在75%甲醇中有相对较好的溶解度，选择75%甲醇超声，样品前处理简单、可控；样品呈弱酸性，选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相；选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶，与乙腈相比更加安全和便宜；波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大，且杂质干扰较少；梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

相似度结果表明，不同批次桑叶样品相似度计算结果均＞0.85，表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定，当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：化学工业出版社，2010：279.

[2]李超，潘建明，罗新根，等.桑叶消渴胶囊对2型糖尿病大鼠的影响[J].海南医学，2012，23（2）：18-20.

[3]陈建国，步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药，2011，42（3）：515-520.

[4]罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学，2005，31（4）：418-421.

[5]阎百传.霜桑叶稳定了我的血压[J].长寿，2008，（12）：43.

[6]王灿，左艇，王琳琳.桑叶黄酮抗皮肤衰老实验研究[J].中国医药导报，2011，8（3）：30-32.

[7]杨燕，王洪庆，陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报，2010，（1）：77-81.

[8]周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.

[9]雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.

[10]郭红霞，谢文剑，曹艺，等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药，2014，21（4）：17-19.

[11]徐韧柳，李丽华，康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志，2005，12（1）：53-54.

[12]孙莲，张丽静，孟磊，等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药，2003，34（1）：78-79.

[13]严安定，袁野，吴亮，等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药，2011，15（3）：296-298.

[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技，2013，（4）：43-44.

[15]张亮亮，汪咏梅，徐曼，等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1064-1066.

[16]张强，孙长波，张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业·学术版，2011，（3）：73-74.

[17]李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44（22）：3095-3104.

（收稿日期：2014-04-08本文编辑：李亚聪）

[作者简介] 彭丽英（1977-），女，湖南怀化人，本科，主管中药师，主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作

▲通讯作者：杨先国（1977-），男，湖南桃源人，讲师，博士，主要研究方向为中药鉴定与质量控制研究

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批，按照2.2下方法制备供试品溶液，分别进样1 μl，记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2.0版）进行分析，生成共有模式指纹图谱，有15个共有峰（图1），其中以峰10（S峰）为参照物，其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。

2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件，得共有指纹图谱（图2），对照品溶液的色谱图见图3，经与对照品对照，指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上数据表明桑叶各批次相似性较好。

3 讨论

本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究，与HPLC相比，UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内，更加快捷和节约溶剂。

本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物，在75%甲醇中有相对较好的溶解度，选择75%甲醇超声，样品前处理简单、可控；样品呈弱酸性，选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相；选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶，与乙腈相比更加安全和便宜；波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大，且杂质干扰较少；梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

相似度结果表明，不同批次桑叶样品相似度计算结果均＞0.85，表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定，当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。

[参考文献]

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[7]杨燕，王洪庆，陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报，2010，（1）：77-81.

[8]周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.

[9]雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.

[10]郭红霞，谢文剑，曹艺，等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药，2014，21（4）：17-19.

[11]徐韧柳，李丽华，康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志，2005，12（1）：53-54.

[12]孙莲，张丽静，孟磊，等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药，2003，34（1）：78-79.

[13]严安定，袁野，吴亮，等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药，2011，15（3）：296-298.

[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技，2013，（4）：43-44.

[15]张亮亮，汪咏梅，徐曼，等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1064-1066.

[16]张强，孙长波，张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业·学术版，2011，（3）：73-74.

[17]李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44（22）：3095-3104.

（收稿日期：2014-04-08本文编辑：李亚聪）

[作者简介] 彭丽英（1977-），女，湖南怀化人，本科，主管中药师，主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作

▲通讯作者：杨先国（1977-），男，湖南桃源人，讲师，博士，主要研究方向为中药鉴定与质量控制研究

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批，按照2.2下方法制备供试品溶液，分别进样1 μl，记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2.0版）进行分析，生成共有模式指纹图谱，有15个共有峰（图1），其中以峰10（S峰）为参照物，其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。

2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件，得共有指纹图谱（图2），对照品溶液的色谱图见图3，经与对照品对照，指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上数据表明桑叶各批次相似性较好。

3 讨论

本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究，与HPLC相比，UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内，更加快捷和节约溶剂。

本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物，在75%甲醇中有相对较好的溶解度，选择75%甲醇超声，样品前处理简单、可控；样品呈弱酸性，选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相；选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶，与乙腈相比更加安全和便宜；波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大，且杂质干扰较少；梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

相似度结果表明，不同批次桑叶样品相似度计算结果均＞0.85，表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定，当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。

[参考文献]

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[5]阎百传.霜桑叶稳定了我的血压[J].长寿，2008，（12）：43.

[6]王灿，左艇，王琳琳.桑叶黄酮抗皮肤衰老实验研究[J].中国医药导报，2011，8（3）：30-32.

[7]杨燕，王洪庆，陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报，2010，（1）：77-81.

[8]周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.

[9]雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.

[10]郭红霞，谢文剑，曹艺，等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药，2014，21（4）：17-19.

[11]徐韧柳，李丽华，康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志，2005，12（1）：53-54.

[12]孙莲，张丽静，孟磊，等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药，2003，34（1）：78-79.

[13]严安定，袁野，吴亮，等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药，2011，15（3）：296-298.

[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技，2013，（4）：43-44.

[15]张亮亮，汪咏梅，徐曼，等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1064-1066.

[16]张强，孙长波，张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业·学术版，2011，（3）：73-74.

[17]李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44（22）：3095-3104.

（收稿日期：2014-04-08本文编辑：李亚聪）

[作者简介] 彭丽英（1977-），女，湖南怀化人，本科，主管中药师，主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作

▲通讯作者：杨先国（1977-），男，湖南桃源人，讲师，博士，主要研究方向为中药鉴定与质量控制研究