韩兰秀,林江,徐昕,钱军,周剑波,王雅丽
(1.江苏大学附属人民医院血液科,江苏镇江212002;2.东南大学医学院附属江阴医院实验室,江苏江阴214400)
建立RQ-PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者6种不同PML/RARα异构体
韩兰秀1,2,林江1,徐昕2,钱军1,周剑波2,王雅丽1
(1.江苏大学附属人民医院血液科,江苏镇江212002;2.东南大学医学院附属江阴医院实验室,江苏江阴214400)
目的:建立检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML/RARα融合基因6种特异性异构体(bcr1/2、P4R3、P46R3、bcr3及P2R3)的实时定量PCR(RQ-PCR)技术,并评价其特异性。方法:设计不同异构体的特异性引物和探针,建立异构体特异性RQ-PCR方法对6种特异性异构体PML/RARα阳性模板进行扩增,评价异构体定量检测的特异性,并检测10例APL患者中不同异构体的含量。结果:所建立的各异构体特异性RQ-PCR法最大敏感性均达10拷贝/μL,但其重复性较差,108~102拷贝/μL阳性模板的重复性良好,正常对照及空白对照无扩增信号,每个异构体特异性RQ-PCR均不能扩增其他异构体。5例长型(bcr1)和1例变异型(bcr2)阳性APL患者中bcr1/2异构体表达量为7.71%~89.71%(中位数13.70%),P4R3异构体表达量为0.71%~16.26%(中位数4.48%),P46R3异构体表达量为3.57%~14.09%(中位数6.33%)。4例短型(bcr3)患者中bcr3异构体表达量为21.43%~197.04%(中位数100.69%),P2R3异构体表达量为0.34%~9.07%(中位数2.45%)。1例短型患者经诱导治疗缓解后bcr3和P2R3异构体转录本明显下降,复发时又明显升高。结论:检测PML/RARα异构体特异性RQ-PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者不同异构体的定量检测和微小残留病灶的随访监测。
聚合酶链反应;急性早幼粒细胞白血病;PML/RARα;异构体
急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓系白血病中的一个特殊亚型,约占10%。90%以上APL患者具有特征性的染色体易位t(15;17)(q22;q12-21),导致融合基因PML/RARα形成,编码PML/RARα融合蛋白,从而导致粒细胞发育受阻于早幼粒细胞阶段。根据PML基因断裂位点的改变,主要产生3种不同的异构体融合基因:长型(bcr1)、短型(bcr3)和变异型(bcr2)。Pandolfi等[1]在1992年即发现长型和变异型PML/RARα阳性的患者中同时存在PML外显子4和RARα外显子3重排(P4R3),导致终止密码子在RARα外显子3中提前出现,可能编码一个异常的截断PML蛋白,短型患者同时存在PML外显子2和RARα外显子3重排(P2R3),也导致终止密码子在RARα外显子3中提前出现,其后国内外一直未有相关研究。目前APL患者中不同PML/RARα异构体共表达的临床意义不明。我们同时设计了bcr1/2、P4R3、P46R3、bcr3和P2R3等6种转录本的特异性引物,建立了异构体特异性实时定量PCR(RQ-PCR)检测方法,并对10例APL患者的冻存样本进行了检测,证明了该方法的可行性。
1.1 标本来源
10例初诊APL患者均为本院住院病例,诊断按文献[2],染色体核型分析均为t(15;17)阳性,且均经RQ-PCR[3]验证。其中5例患者为长型PML/RARα阳性,1例患者为变异型PML/RARα阳性,4例为短型PML/RARα阳性。阳性对照选用NB4细胞株,正常对照取自血常规正常的10例胸外科肿瘤患者的肋骨骨髓。
1.2 细胞分离、RNA提取及反转录
每例患者均于初诊时抽取肝素抗凝骨髓标本2 mL,用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),Trizol一步法提取总RNA,经紫外分光光度仪定量,取RNA 2.0μg应用6随机引物反转录合成第1链cDNA,反应体系为40μL,含MMLV反转录酶200 U、dNTP(每种0.5 mmol/L)、10 mmol/L DTT、25 U RNA酶抑制剂,于37℃反转录1 h、95℃5 min灭活,cDNA储存于-20℃备用。
1.3 RQ-PCR引物、探针的合成及阳性模板的制备
利用Primer 5.0软件设计特异性异构体的上游引物,其中bcr1/2的上游引物设计在PML第5外显子上,可以同时扩增bcr1和bcr2异构体转录本,共用下游引物和探针来自“欧洲抗癌计划”[4]。引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成。见表1。
表1 不同PM L/RARα异构体特异性RQ-PCR的引物和探针序列
分别应用5种异构体特异性RQ-PCR扩增长型和短型APL患者的cDNA标本,得到相应的扩增产物。将扩增产物纯化,连接到PGEM-T载体(美国Promega公司),再转入DH5α感受态中。利用蓝白斑筛选挑取白色阳性菌落克隆,经上海基康生物技术公司测序鉴定后进行质粒抽提、定量,最后从108拷贝/μL开始进行10倍稀释建立阳性模板梯度,置于4℃储存备用。
1.4 RQ-PCR检测患者PML/RARα融合基因异构体含量
PCR反应体系为25μL,含10×缓冲液2.5μL、MgCl24.0 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.5 μmol/L、探针0.2μmol/L、Taq酶1.0 U、50×ROX 0.5μL和cDNA 50 ng。反应在7300扩增仪(ABI公司)上进行,95℃预变性5min,然后94℃15 s、60℃1 min,共45个循环。扩增仪利用电荷偶联装置(CCD)照相机每隔7秒实时检测一次释出的荧光信号,最后应用SDS 1.4软件进行数据分析。为了保证检测结果的特异性和可信性,该RQ-PCR方法检测患者cDNA时均附带了不同浓度的阳性模板cDNA,正常对照cDNA和空白对照(NTC)。应用看家基因ABL作为内参照[3]。PML/RARα转录本的绝对量表示为每50 ng总RNA中含有的拷贝数,而每个患者中PML/RARα转录本的值则以相对量表示(NPML/RARα=PML/RARα转录本的拷贝数/ABL拷贝数×100%)。
1.5 不同异构体定量检测的特异性评价
用每种特异性异构体RQ-PCR反应体系扩增其他异构体的阳性模板,评价异构体间定量检测的特异性。
1.6 统计学处理
应用SPSS 10.0软件包进行相关中位数统计处理。不同浓度PML/RARα融合基因异构体重复6次的检测结果采用±s表示。
2.1 RQ-PCR方法的敏感性、重复性、特异性
应用不同浓度质粒标准品所建立的5组标准曲线(图1)均达到了良好的敏感性、重复性和特异性。最大敏感度均达到10拷贝/μL,但10拷贝/μL的重复性不好,而108~102拷贝/μL重复性良好(表2)。10例正常对照及空白对照无任何阳性信号扩增。标准曲线的相关参数见表3。
图1 不同浓度PM L/RARα异构体重组质粒RQ-PCR的荧光扩增结果及其标准曲线
表2 不同浓度PML/RARα融合基因异构体检测结果
表3 PM L/RARα融合基因异构体标准曲线的相关系数
2.2 不同异构体RQ-PCR定量检测的特异性
每个异构体RQ-PCR体系只能扩增相应的特异性异构体阳性模板,对其他特异性异构体的阳性模板均无扩增。
2.3 初诊APL患者中PML/RARα特异性异构体转录本含量
6例长型或变异型APL患者中bcr1/2异构体相对定量为7.71%~89.71%(中位数13.70%),P4R3异构体相对含量为0.71%~16.26%(中位数4.48%),P46R3相对含量为3.57%~14.09%(中位数6.33%)。4例短型患者中bcr3异构体相对含量为21.43%~197.04%(中位数100.69%),P2R3异构体相对含量为0.34%~9.07%(中位数2.45%)。见表4。
表4 10例APL患者各种PM L/RARα融合基因异构体检测结果
2.4 10例APL患者的随访监测
我们对10例APL患者的冻存样本进行了随访监测,截止到随访结束,仅有1例短型APL患者复发并死亡,其余9例患者均处于完全缓解期。死亡的1例患者在复发后4个月死于化疗后骨髓抑制伴败血症。
以往对APL等白血病的诊断及微小残留病灶的监测主要有细胞遗传学、荧光原位杂交技术(FISH)、Nouthern印迹、定性(半定量)PCR等技术。RQ-PCR技术具有快速、特异、敏感性高、可定量等优点,在临床上的应用日益广泛,然而,应用RQPCR方法来检测APL患者的PML/RARα融合基因6种异构体的研究却很少见。
由于目前国内外所应用的几种RQ-PCR引物缺乏异构体特异性,在同一反应体系中能同时扩增几种异构体,多为不同异构体的共同表达水平,无法提供每一异构体的各自转录水平,因此,检测结果提供的定量信息不准确,降低了对APL患者的预后评价和微小残留病灶监测的效用。为此,我们设计了PML/RARα融合基因不同异构体的特异性引物,成功建立了6种异构体的特异性定量检测方法。该方法的建立具有如下意义:①可以精确定量PML/RARα融合基因中各异构体的相对含量,便于异构体间含量的比较;②为探讨初诊APL患者PML/ RARα融合基因各异构体含量的临床意义提供了方法学保证;③可以动态监测异构体含量变化,判断其在预测患者复发中的作用。1例短型复发患者冻存标本的检测结果表明,在患者发生血液学复发前,其特异性短型和P2R3异构体含量均增高,证实了异构体监测在提示临床复发中的作用。虽然几个PML/RARα异构体已被发现多年,但其病理意义尚未完全明了。许多临床和实验研究均集中于3个常见的异构体(bcr1、bcr2和bcr3),并证实了其在APL中的致病机理以及在预后评价和微小残留病灶检测中的作用[5-6]。而对于P4R3、P46R3及P2R3等异构体的研究仍处于探索阶段。Ashur-Fabian等[7]发现长型APL患者经治疗后当荧光原位杂交检测转阴时,34例患者中有9例RTPCR仍可检出P46R3转录本,其中5例患者在随访过程中复发。最近又有报道显示转染了P4R3异构体的U937细胞株对于全反式维甲酸的敏感性低于P46R3和bcr1[8]。
我们所建立的异构体特异性RQ-PCR方法特异、敏感、可靠,可以对PML/RARα融合基因异构体进行定量检测。我们将进一步扩大病例进行检测,以进一步明确不同异构体的临床意义。
[1]Pandolfi PP,Alcalay M,FagioliM,etal.Genomic variability and alternative splicing generatemultiple PML/RARαtranscripts thatencode aberrant PML proteins and PML/RARαisoforms in acute promyelocytic leukaemia[J].EMBO J,1992,11(4):1397-1407.
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Quantification of six different PM L/RARαisoform s in patients w ith acute prom yelocytic leukem ia using quantitative real time PCR
HAN Lan-xiu1,2,LIN Jiang1,XU Xin2,QIAN Jun1,ZHOU Jian-bo2,WANG Ya-li1
(1.Department of Hematology,the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212002;2.Department of Laboratory,the Affiliated Jiangyin Hospital,College of Medicine,Southeast University,Jiangyin Jiangsu 214400,China)
Objective:To establish a quantitative real time PCR(RQ-PCR)method for detecting the six different PML/RARαisoforms(bcr1/2,P4R3,P46R3,bcr3,P2R3)in acute promyelocytic leukemia(APL)patients,and evaluate the specificity of isoform-specific RQ-PCR.M ethods:Specific primers and probe of different isoforms were designed and isoform-specific RQ-PCR method for detecting each isoform was established.To evaluate the utility of this assay,bonemarrow samples from 10 APL patientswere detected.Results:In repeated tests,maximal sensitivity of 10 copies/μL for each isoform-specific RQ-PCR was obtained,however,the reproduciblemaximal sensitivities achieved 100 copies/μL.In the normal controls and the no-template control,any amplified fluorescent signalswere not detected.Each isoform-specific RQ-PCR could not amplify other isoforms.In five bcr1-positive cases and one bcr2-positive case,the expression level of bcr1/2,P4R3 and P46R3 isoformswas7.71%-89.71%(median 13.70%),0.71%-16.26%(median 4.48%),3.57%-14.09%(median 6.33%),respectively.In four bcr3-positive cases,the expression level of bcr3 and P2R3 isoforms was 21.43%-197.04%(median 100.69%)and 0.34%-9.07%(median 2.45%).The expression level of bcr3 and P2R3 isoforms significantly de-creased in one case achieving complete remission after induction therapy compared to that in initial diagnosis,and significantly increased after relapse.Conclusion:Isoform-specific RQ-PCR method for six PML/RARαisoformswas a sensitive,reliable quantitative assay and could be used in the detection of the six different PM/RARαisoforms of APL and themeasurement ofminimal residual disease.
polymerase chain reaction;acute promyelocytic leukemia;PML/RARα;isoform
R783.5
A
1671-7783(2014)04-0324-04
10.13312/j.issn.1671-7783.y140135
江苏省医学重点人才资助项目(RC2007035);江苏省自然科学基金资助项目(BK2009206);镇江市社会发展项目(SH2008041)
韩兰秀(1981—),女,主治医师,硕士,主要从事中心实验室的管理和实验操作;钱军(通讯作者)主任医师,硕士生导师,E-mail:qianjun0007@sina.com
2014-05-22 [编辑]陈海林