镁合金对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响研究

张 涛，武肖娜，尹庆水，夏 虹，黄华扬，张 余，李 梅，蓝国波

镁合金是新兴可降解金属材料，具有良好的降解性及生物相容性，近年来受到材料学界及医学界的广泛关注。但是作为一种骨科植入材料，镁合金对骨再生的关键细胞——骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的成骨分化过程是否存在影响，目前尚不明确。本研究采用镁合金浸提液培养BMSCs并进行诱导分化，研究其对BMSCs增殖活性及成骨分化性能的初步影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

DMEM低糖培养基、胎牛血清、2.5 g/L胰酶、PBS缓冲液（美国，Hyclone公司），CCK试剂盒（日本，同仁公司），DMSO（美国，Sigma 公司），Percoll淋巴细胞分离液（密度1.073 g/mL，美国，Gibico公司）。成骨诱导剂：1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.2 mmo1/L L-抗坏血酸（美国，Sigma公司）。PrimeScriptRT reagent Kit Perfect Real Time（逆转录试剂盒）、SYBR Green Premix Ex Taq（荧光定量PCR试剂盒）、DNA上样缓冲液、Trizol裂解液（日本，Takara公司）。

超纯水机（美国，Aquapro公司）、酶联免疫检测仪（美国，Thermo公司）、4000型台式低速离心机（日本，KUBOTA公司）、CO2细胞培养箱（美国，Froma Scientific公司）、PCR仪（日本，TAKARA公司）、DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）、LightCycler 480荧光定量PCR仪（德国，Roche公司）、流式细胞仪（美国，BD公司）。

1.2 人BMSCs的分离培养及鉴定

常规无菌条件下从6名捐献骨髓健康志愿者髂后上嵴穿刺抽取骨髓5 mL，再连接已肝素化处理的10 mL注射器针筒，迅速转移至含5 mL Percoll的离心管，采用密度梯度离心法，将界面处一白色薄层（细胞层）吸出，转移至另一离心管中，PBS液洗涤2次，弃去上清液后加入DMEM低糖培养液，轻吹打分散，制成细胞悬液。加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液2 mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。取第3代细胞用于后续实验。

收集培养细胞，取1×104个细胞用PBS液调整至100 μL，经多聚甲醛固定后用流式细胞仪检测CD34、CD45、CD44、CD73、CD90和CD105的表达情况[1]。

1.3 镁合金浸提液的制备

根据ISO10993[2]，按材料表面积/浸提介质为1.25 cm2/mL的比例，向装有镁合金AZ31B（中科院金属所制备提供）的容器中加入含10%胎牛血清的L-DMEM细胞培养液，放于37℃CO2培养箱中孵育，浸泡24 h，提取液置4℃冷藏，24 h之内使用。无涂层镁合金浸提液的pH值较高（8.4～8.8），采用稀盐酸调整其酸碱性能（7.3～7.5），称之为pH-AZ31B组。

同样根据ISO10993[2]材料表面积/浸提介质比例标准，向装有镁合金的容器中分别加入含成骨诱导剂（1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.2 mmo1/L L-抗坏血酸）和10%FBS的L-DMEM培养基的成骨诱导液，置于37℃CO2培养箱中孵育，浸泡24 h，获取具有诱导活性的条件浸提液。

1.4 CCK法检测细胞增殖活性

将人BMSCs用0.25%胰蛋白酶消化，将1×104／L的细胞悬液200 μL接种于96孔板中，培养24 h后将培养液分别换为2组浸提液，对照组加入L-DMEM细胞培养液。每2 d更换1次，分别培养1、3、5、7 d后弃浸提液，PBS清洗后加入CCK-820μL，同样条件下继续培养2 h，用酶联免疫检测仪测定450 nm处的吸光度（optical density，OD）值。按公式计算相对增殖率：相对增殖率=（试验组OD值/对照组OD值）×100%，据此评价材料的细胞毒性分级[2]。

1.5 定量PCR检测

将培养至对数生长期的细胞消化，调整细胞浓度至1×105/L，每孔2 mL种植于6孔板中，每组3个复孔，待细胞贴壁后，对照组更换培养液为含成骨诱导剂（1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.2 mmo1/L L-抗坏血酸）和10%FBS L-DMEM培养基的成骨诱导液，实验组更换为条件培养液进行培养。每2 d换液一次，培养至6、12 d时收集细胞。每孔加入1 mL Trizol裂解液裂解细胞，使用Trizol试剂提取细胞总RNA，合成cDNA，设置内参基因（β-actin基因），进行定量PCR检测。于成骨分化诱导后6、12 d检测各组ALP、COLⅠ和OPN基因的表达情况。

1.6 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有数据采用均数±标准差（±s）表示。各组间数据采用析因设计方差分析，多重比较应用LSD法，方差不齐时采用Dunnetts T3比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs鉴定

流式细胞仪检测结果提示CD34（—）、CD45（—）、CD44（+）、CD73（+）、CD90（+）、CD105（+）。

2.2 BMSCs细胞增殖活性

如图1所示，AZ31B组细胞增殖能力显著低于对照组（P＜0.05），pH-AZ31B组细胞增殖能力与对照组无明显差异（P＞0.05）。

图1 骨髓间充质干细胞增殖活性

图2 骨髓间充质干细胞相对增殖率

如图2所示，AZ31B组相对增殖率在培养7 d时＜80%，说明镁合金有一定毒性，毒性评级为2级[2]；pH-AZ31B组细胞增殖活力在4个时间点均＞80%，毒性分级为1级[2]。AZ31B组细胞增殖率显著低于对照组，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；pH-AZ31B组细胞增殖率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 定量PCR检测各基因表达量

2.3.1 COLⅠ基因表达情况 如图3所示，随着培养时间的延长，两组COLⅠ基因表达逐渐增加；与BMSCs共培养6、12 d，AZ31B组COLⅠ基因表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3.2 ALP基因 如图4所示，与BMSCs共培养6、12 d，pH-AZ31B组ALP表达量与对照组比较，差异无统计学差异（P＞0.05）；但未调整pH值的AZ31组ALP表达明显低于对照组和pH-AZ31B组（P＜0.05）。结果提示pH值可能是镁合金影响ALP基因表达的因素之一。

2.3.3 OPN基因 如图5所示，与BMSCs共培养6、12 d，pH-AZ31B组OPN基因表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；但未调整pH值的AZ31组OPN表达明显高于对照组和pH-AZ31B组（P＜0.05）。结果提示pH值可能是镁合金影响OPN基因表达的因素之一。

3 讨论

3.1 BMSCs的鉴定

骨髓中的BMSCs含量很少，实际应用时需要进行分离纯化和体外扩增。目前用于分离BMSCs的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法等，其中较为常用的是全骨髓贴壁法和密度梯度离心法。本研究采用密度梯度离心法进行BMSCs的分离，然后行细胞培养，最终经过鉴定来明确细胞的类型。

图3 COLⅠ基因表达情况

图4 ALP基因表达情况

图5 OPN基因表达情况

常用的鉴定方法主要包括细胞形态鉴定、多向诱导分化鉴定、干细胞表面标记物鉴定等，其中表面标记物鉴定具有非专一性和种属特异性，临床应用较为广泛。MSCs可以表达多种细胞的表面标志，以及多种细胞因子、黏附分子和生长因子的受体[3]。人MSCs与造血干细胞共同存在于骨髓中，但MSCs不表达典型造血细胞表面抗原，如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45 等[4]，仅 表 达 CD29、CD44、CD90、CD105、CD166等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志[5]，还有文献报道，CD105+、CD73+、CD90+和CD45－、CD34－、CD14－这一细胞表型的细胞可提示为MSCs[6]。

本实验中CD34表达量极小，提示不表达造血细胞的表面标志；CD45是泛白细胞标志物，又称白细胞共同抗原，其在MSCs表达较低，且在人工培养下很快失去阳性表达[6]，本实验第3代MSCs显示CD45为阴性，与文献报道一致。CD44为一种黏附分子，是骨桥蛋白和透明质酸的受体，在骨髓组成中起重要作用，本实验CD44在MSCs表达呈强阳性，也证实其表型特异性[7]；CD105又称转化生长因子-β受体，是构成细胞膜整体所必需的蛋白质；CD73存在于淋巴细胞B细胞亚群和T细胞亚群、滤泡树突细胞、上皮细胞等，可能是淋巴细胞的成熟标志；CD90同时表达于脑和淋巴组织。本实验此4种抗原均呈强阳性表达，具有一定程度的特异性，证实所获取BMSCs纯度较高。

3.2 镁合金对BMSCs增殖的影响

作为具有成骨作用的主要细胞之一，BMSCs主要应用于成骨分化及评估材料的成骨性能[8-9]。镁合金是近年来受到广泛关注的一种新型金属材料，对其生物相容性的评估目前主要采用成纤维细胞。随着研究的逐步深入，学者们发现镁合金可用作骨科植入材料及心脑血管支架材料，因此开始采用成骨细胞及内皮细胞进行生物相容性评价。但镁合金对BMSCs生物学行为是否造成影响，目前相关报道不多。有学者采用BMSCs研究镁合金表面的黏附性能[10]，Zhang等[11]应用BMSCs进行镁合金的细胞毒性研究，结果显示镁合金浸提液对BMSCs具有细胞毒性作用，但经过微弧氧化表面改性后，其生物相容性能改善明显。上海交通大学的Yang等[12]采用人BMSCs进行3种镁合金材料的生物学性能研究，结果提示3种镁合金均存在部分细胞毒性，但对其浸提液进行pH值调整后，即表现出良好的增殖活性。

本研究镁合金细胞增殖实验结果与文献报道相似[11-12]，共培养7 d时存在2级细胞毒性，结合文献及前期研究结果，我们设置调整pH值组，结果发现调整pH值的镁合金浸提液细胞毒性为1级，具有良好的生物相容性。

3.3 镁合金对BMSCs成骨分化的影响

基因表达检测结果提示，镁合金组ALP基因表达量显著降低，OPN基因表达量显著增高；但消除浸提液酸碱性影响后的调整pH值浸提液组ALP和OPN基因表达量与对照组无显著差异，提示浸提液的酸碱性能可能是影响成骨分化基因表达的重要因素。至于镁合金对其他成骨分化基因及成骨作用是否造成影响，还有待于进一步深入的研究。

综上所述，BMSCs在镁合金浸提液中具有较好的增殖活性，细胞毒性为2级；调整pH值后的镁合金浸提液具有良好的生物相容性。提示镁合金对于BMSCs成骨分化过程无不良影响，其产生的部分改变可能是镁合金浸提液pH值影响所致。

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