降胆固醇能力强的耐酸耐胆盐乳酸菌的筛选及鉴定

温子辉，李大鹏，张文天，何世鹏，郑大浩，尚伟豪，雷彦平

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

近年来，随着人们健康意识的逐步增强，食品、保健品和医药等的安全性越来越受到人们的关注。从上个世纪70年代开始，科学家发现乳酸菌的食用能起到降人体血液中胆固醇的作用[1]。Grill 等[2]给血清总胆固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌制剂，8 个月后发现被测人群血清胆固醇含量均显著下降。于景华等[3]通过建立益生菌的纯培养模型和发酵模型并将其应用于筛选降胆固醇益生菌的研究中，结果表明：实验菌株均表现出了不同的脱除能力，并且菌株脱除胆固醇的能力与其自身特性有关。此外，郭东起等[4]通过科学的方法经体外降胆固醇能力实验、耐酸耐胆盐实验、细胞黏附实验和抑菌实验分离筛选出了6 株具有降胆固醇功能的乳酸菌，初步确定乳酸GL-A 为潜在的功能性益生菌。居华等[5]从香肠、腊肉、泡菜、酸奶中筛选出6 株降胆固醇能力较高的乳酸菌，研究表明源于发酵酸奶中的植物乳杆菌P15 对蛋黄和化合物胆固醇的降解率最高，这也充分表明了降胆固醇益生菌菌株的多样性。具有降胆固醇的乳酸菌在发酵食品领域具有广泛的应用前景。实验进行了降胆固醇乳酸菌的筛选，对其耐酸耐胆盐能力进行了研究，为实际应用提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

从发酵酸菜中分离出的7 株乳酸菌，分别代号M4、M5、M7、M8、M 10、M16、M17。

1.1.2 培养基

（1）MRS 液体培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，碳酸钙10 g，吐温80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，用盐酸将pH 调至6.0。121 ℃湿热灭菌15 min[6]。

（2）MRS 固体培养基：琼脂15 g，其他营养物质同MRS 液体培养基。

（3）MRS-CHOL 培养基[5]。

1.1.3 主要仪器设备

高压蒸汽灭菌锅、离心机、干燥箱、恒温培养箱、冰箱、转式恒温调速摇床恒温箱、分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 降胆固醇能力强菌株的筛选

分别以1%和5%的接种量将菌株菌悬液接种于MRS-CHOL 培养基[5]中，于恒温振荡培养箱恒温培养，培养条件是37 ℃，振荡速度60～80 r·min-1，培养72 h 后分别测定菌株降解胆固醇的能力。

菌株降解胆固醇能力的测定：将菌株液体培养物和MRS-CHOL 培养基摇匀后吸取0.2 mL 装于有4.8 mL无水乙醇的离心管中，混匀；10 min 后4 000 r·min-1离心5 min；取上清液2 mL 于试管中，加入2 mL 硫酸铁铵工作液，摇匀，以2 mL 无水乙醇加入2 mL 硫酸铁铵工作液为空白，30 min 后于560 nm 下测样品的吸光度，并计算胆固醇的降解率[7]。

计算方法：胆固醇降解率（%）=（胆固醇总量-上清中胆固醇的量）/胆固醇总量。

1.2.2 耐酸性的能力的测定

挑取斜面菌种于MRS 液体培养基中，30 ℃培养16～18 h。将菌悬液4 000 r·min-1离心15 min，用无菌生理盐水洗涤，并将沉淀悬浮于等体积的无菌生理盐水中。将制备好的细胞悬浮液接入pH 为2 和pH 为3 的磷酸盐缓冲液中30 ℃培养1 h 和2 h。培养完成后进行10 倍梯度稀释，取0.1 mL 的稀释液涂布在MRS 固体培养基上30 ℃培养2 d，进行细胞计数[8]。

1.2.3 耐胆盐的能力的测定

挑取斜面菌种于MRS 液体培养基中，30 ℃在恒温培养箱中培养16～18 h。将培养基摇匀，再取10 mL培养液离心收集菌泥，6 000 r·min-1离心15 min，收集菌泥，加入等体积的生理盐水混合均匀。将细菌悬浮液接入灭菌的含有0%、0.3%、0.5%、1.0%胆盐的10 mL MRS 液体培养基中培养，10 倍梯度稀释后涂布MRS固体培养基上30 ℃培养2 d，进行细胞计数[8]。

1.2.4 菌种的鉴定

（1）个体形态观察

将菌种细胞制成水浸片，革兰氏染色后，干燥，镜检。

（2）菌落形态观察

将菌株培养液稀释，涂布在MRS 固体培养基上，30 ℃培养16～18 h，观察菌落形态特征。

（3）生理生化实验

鉴定方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]对菌种进行生理生化实验[9]。

2 实验结果与分析

2.1 降胆固醇能力强的菌株的筛选

由表1 可见，将从发酵酸菜中筛选的7 株乳酸菌在MRS-CHOL 培养基中培养72 h 后，M16 菌株的胆固醇降解率最大，胆固醇降解率为52.21%。因此选择M16 菌株作为降胆固醇能力强的菌株。

2.2 菌种耐酸性能力的测定

由表2 可以看出，酸对M16 菌株的细胞活性影响显著。随着培养时间的延长，活细胞数呈下降的趋势，随着pH 的降低，活细胞数也显著下降。M16 菌株的细胞在pH 2 环境中30 ℃培养2 h 后活细胞数仍然可以达到4.5×106CFU·mL-1。Conway 等[10]报道L.acidophilus ADH，L.acidophilus N2 当在pH 2.0 的环境下1.5 h 后，其活细胞数下降到10 CFU·mL-1以下。人体胃中的pH 为2～3，因此M16 菌株具有较好的耐酸性，可以耐受人体的胃酸环境。

2.3 菌种耐胆盐能力的测定

表1 菌株胆固醇降解率Table 1 Degradation rate of strains cholesterol

表2 M16 在酸性条件下培养的活菌数量（CFU·mL-1）Table 2 The number of live bacteria in acidity of M16（CFU·mL-1）

表3 M16 在胆盐条件下培养的活菌数量（CFU·mL-1）Table 3 The number of live bacteria in bile of M16（CFU·mL-1）

由表3 可以看出，胆盐对M16 菌株的细胞活性影响显著。随着培养时间的延长，活细胞数呈下降的趋势，随着胆盐浓度的提高，活细胞数也显著下降。M16 菌株在1.0%胆盐的环境中培养4 h 后活细胞数仍然可以达到1.0×106。Bhardwaj 等人[11]报道当在0.5%的胆盐中培养1 h 后E.faecium FH 99 的活细胞数由108CFU·mL-1下降为104CFU·mL-1。人体胃中的胆盐含量不超过0.5%，因此M16 菌株具有较强的耐胆盐的能力。

2.4 菌种的鉴定

2.4.1 形态观察

（1）个体形态特征观察

图1 M16 菌株个体形态（10×100）Fig.1 The individual form of M16

由图1 可以看出，M16 细胞革兰氏染色呈阳性，形态为杆状。单个或连成成链，不运动，不产芽孢，无荚膜，过氧化氢酶实验阴性，是厌氧、微好氧或兼性好氧的细菌。

（2）菌落形态特征观察

由图2 可见，在MRS 固体培养基上37 ℃培养12 h，菌落直径为0.8～1.4 mm，乳白色，有光泽，不透明，边缘整齐，扁平，有微微的酸味。

图2 M16 菌株菌落特征Fig.1 Colony characteristics of M16

2.4.2 生理生化实验

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]进行生理生化实验，实验结果见表4。

表4 M16 菌株生理生化实验结果Table 4 Results of physiology and biochemistry experiments in bile of M16

由表4 可以看出，M16 菌株的生理生化实验结果与《乳酸菌鉴定手册》中乳杆菌属一致，因此将M16 菌株鉴定该种乳酸菌为乳杆菌属的乳酸菌。

3 结论

（1）从发酵酸菜中分离出的7 株乳酸菌中筛选出胆固醇降解率为52.21%的菌株M16。

（2）M16 菌株进M16 具有较强的耐酸耐胆盐能力。

（3）通过个体形态和菌落特征观察及生理生化实验结果综合分析，将M16 鉴定为乳杆菌属的乳酸菌。

［1］李杰，李炳仁，李琴.乳制品中嗜酸乳杆菌的益生特性［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（3）：43-46.

［2］Grill J P，Cayuela C，Antoine J M，et al.Effects of Lactobacillus amylovorus and Bifidobacterium breve on cholesterol［J］.Letters in Applied Microbiology，2000（31）：154-156.

［3］于景华，李里特，吕加平，等.潜在益生菌菌株脱除胆固醇特性研究［J］.中国乳品工业，2006，34（7）：20-23.

［4］郭东起，侯红漫，刘阳，等.降胆固醇益生乳酸菌的体外筛选［J］.中国乳品工业，2007，35（8）：11-14.

［5］居华，刘书亮，敖灵，等.降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及生长特性［J］.中国乳品工业，2007，35（8）：7-10.

［6］玉华.鼠李糖乳杆菌耐酸及胆盐能力研究［D］.长春：吉林农业大学，2009.

［7］王俊华.降胆固醇益生乳杆菌的筛选及其降胆固醇作用的研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2008.

［8］吕燕妮.戊糖乳杆菌31-1 菌株产细菌素研究［D］.北京：中国农业大学，2004.

［9］布坎南R E，吉本斯N E.伯杰氏细菌鉴定手册［M］.8版.北京：科学出版社，1984.

［10］Conway P L，Gorbach S L，Goldin B R.Survival of catallactic bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells［J］.Journal of Dairy Science，1987，70：1-12.

［11］Bhardwaj A，Kaur G，Gupta H，et al.Interspecies diversity，safety and probiotic potential of bacteriocinogenic enterococcus faecium isolated from dairy food and human faeces ［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27：591-602.