急性髓系白血病CTNNA1基因的表达及临床意义

陈星星，钱军，林江，安翠，马吉春，邓兆群，陈芹，杨静，李云，钱震，刘清，唐春艳

（江苏大学附属人民医院1.血液科，2.中心实验室，江苏镇江212002）

急性髓系白血病CTNNA1基因的表达及临床意义

陈星星1，钱军1，林江2，安翠1，马吉春2，邓兆群2，陈芹2，杨静1，李云1，钱震1，刘清1，唐春艳1

（江苏大学附属人民医院1.血液科，2.中心实验室，江苏镇江212002）

目的：研究急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）患者钙黏蛋白相关蛋白（α-catenin，CTNNA1）基因的表达情况并探讨其临床意义。方法：应用实时定量PCR（qRT-PCR）法检测25例非恶性血液病患者（对照组）和92例初诊AML患者（观察组）中CTNNA1基因的表达水平，并分析其与临床参数的相关性。结果：观察组中51例（51／92，55.43%）存在CTNNA1低表达，而对照组未发现CTNNA1低表达（0.00%），两组比较，差异有统计学意义（χ2＝17.152，P＜0.001）；CTNNA1表达水平与AML患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型、核型分组之间均无相关性（P均＞0.05）。ROC曲线分析表明CTNNA1表达水平能有效鉴别观察组和对照组，AUC＝0.806。观察组中CTNNA1低表达的患者化疗后完全缓解率高于对照组，但差异无统计学意义（χ2＝2.476，P＝0.142）。4例初诊AML患者在获得完全缓解后CTNNA1表达水平均较治疗前有所升高。结论：CTNNA1基因低表达可能是AML中的一个常见分子事件，检测其表达可用于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测。

钙黏蛋白相关蛋白；急性髓系白血病；基因表达

连环素是细胞内控制细胞黏附功能并作为与细胞骨架微丝蛋白相连接的一组黏附分子，主要有α、β及γ3种［1］，尤其是钙黏蛋白相关蛋白（α-catenin，CTNNA1）被认为是连接E-表皮钙黏蛋白-β-连环素复合体和肌动蛋白纤维的重要蛋白［1－2］。CTNNA1表达的下调或缺失可导致表皮钙黏蛋白复合体（E-cd／cat）功能失调［3］，从而使细胞间的接触抑制丧失，肿瘤细胞无限制地增生，失去分化能力，细胞间连接松散易于从局部脱落，且侵袭能力较强，极易扩散和转移［4］。CTNNA1基因位于染色体5q31，其编码的蛋白在正常组织中普遍表达［5］，而在多种肿瘤组织中表达下调，且与肿瘤的进展及预后密切相关［6］。因此，我们拟应用实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）研究急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）患者CTNNA1基因的表达情况，并探讨其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2005年10月至2011年10月在江苏大学附属人民医院住院治疗的92例AML初诊患者，作为观察组。其中，男55例，女37例，年龄9～87岁（中位53岁）。临床诊断按照FAB和WHO 2008版标准（原始细胞≥20%）［7］。核型分析应用常规R显带技术，核型分组按照文献［8］进行。另选择非恶性血液病患者25例作为对照组，包括正常健康者5例，特发性血小板紫癜2例和缺铁性贫血18例。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离与RNA制备 全部患者均于初诊时抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，应用Trizol法提取总RNA，经紫外分光光度仪测RNA浓度及纯度（D260／D280比值在1.8～2.0之间），－80℃保存备用。

1.2.2 反转录 2.0μg总RNA经随机引物反转录合成第1链cDNA，总体系40μL，其中含200 U反转录酶（M-MLV，MBI Fermentas，美国）、0.5 mmol／L dNTPs、10 mmol／L还原剂（DTT）、25 U RNA酶抑制剂。反应条件为25℃10 min，42℃60 min。cDNA于－20℃储存备用。

1.2.3 qRT-PCR 引物设计采用Primer Premier 5.0软件，CTNNA1引物序列：上游5′-ATGCCATAATCAGAACAC-3′，下游5′-ACTGCCTTAGCAAACAC-3′，扩增片段为146 bp；内参为ABL管家基因，引物序列：上游5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。25μL PCR反应体系包括1×缓冲液，dNTP 0.2 mmol／L，MgCl24 mmol／L，上下游引物0.4μmol／L，荧光染料（20× EvaGreen），荧光定量PCR参比染料（50×Rox），1.0 U Taq DNA聚合酶（MBIFermentas，USA）和50 ng cDNA。反应在ABI7300扩增仪（ABI公司）上进行，扩增条件为94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，80℃收集荧光30 s，共40个循环。熔解曲线程序为95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，60℃15 s。每次扩增均以重组CTNNA1质粒为阳性对照，以双蒸水作为无模板对照（NTC）。熔解曲线揭示PCR产物为单一峰，2%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物长度正确。随机选取2例PCR产物进行测序证实序列正确。

1.2.4 阳性模板及标准曲线的制备 内参ABL及CTNNA1表达的引物序列同上，将1例AML患者的ABL及CTNNA1表达的定性PCR扩增产物克隆入PGEM-T载体，扩增后纯化回收，连接过夜后重组载体，提取质粒，测序鉴定（上海生工生物工程公司）完全正确，分别将其定量；从108拷贝／μL开始进行10倍稀释，建立阳性模板梯度后分别进行qRT-PCR扩增，绘制阳模标准曲线。选取CTNNA1与ABL表达ΔCT值最小的1例对照标本作为对照。CTNNA1基因表达采用如下公式：NCTNNA1＝（E）ΔCT CTNNA1（对照－标本）／（E）ΔCT ABL（对照－标本）；

CTNNA1 ABL PCR扩增效率E＝10（－1／斜率）；ΔCT指对照与标本之间CTNNA1和ABL循环阈值（CT）值的差异。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。计量资料之间的差异分析采用Kruskal-Wallis（多组间比较）或Mann-Whitney U检验（两组比较），计数资料的差异分析采用卡方检验或Fisher确切概率法；CTNNA1表达与临床资料之间的相关性分析采用Spearman秩和检验；生存时间分析采用Kaplan-Meier法；CTNNA1表达在AML中的诊断价值采用接收者操作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲线及曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）进行评价；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTNNA1基因的表达

对照组中CTNNA1的表达水平为0.28～4.16（1.34±1.01）；因此，以NCTNNA1＜0.33为依据判断AML患者中CTNNA1为低表达，AML患者中CTNNA1表达水平为0.00～8.21（0.65±1.24），与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。对照组和观察组中CTNNA1低表达阳性率分别为0.00%（0／25）和55.43%（51／92），两组比较差异有统计学意义（χ2＝17.152，P＜0.001）。

2.2 CTNNA1基因的表达与临床参数相关性

CTNNA1表达水平与AML患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型及不同核型分组之间均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 AM L患者的CTNNA1表达水平与临床参数之间的关系

2.3 CTNNA1表达与AML患者预后之间的关系

结果显示，观察组中CTNNA1低表达患者化疗后的完全缓解率（63%）高于对照组患者（46%），但差异无统计学意义（χ2＝2.476，P＝0.142）。73例患者具有随访资料，CTNNA1低表达与CTNNA1正常表达两组患者的总体生存时间相比，差异无统计学意义（χ2＝0.003，P＝0.960）。见图1。

2.4 CTNNA1表达作为诊断标志的意义

应用ROC曲线评价CTNNA1表达水平能否作为AML患者辅助诊断的一个潜在标志，结果显示，CTNNA1表达水平能有效鉴别观察组AML患者和对照组患者，AUC＝0.806（95%可信区间为0.723～0.890）（图2）。在CTNNA1表达水平为0.11时，诊断AML的敏感性和特异性分别为71%和100%。

2.5 CTNNA1表达在AML随访中的意义

对CTNNA1表达水平较低的4例初诊AML患者的骨髓标本进行治疗前后的检测，结果显示，患者病情获得完全缓解后的CTNNA1表达水平较治疗前均有所升高。见图3。

图1 AM L患者的总体生存时间分析

图2 CTNNA1表达水平辅助诊断AM L的ROC曲线

3 讨论

研究揭示，多种实体肿瘤细胞中存在着CTNNA1基因突变或表达下调，且与患者的疾病进展、转移和预后不良密切相关［9－11］；CTNNA1表达缺失可导致细胞黏附能力下降，促进肿瘤形成［12］。另有研究指出，白血病干细胞中也存在着CTNNA1表达下调，其表达改变受启动子甲基化和组蛋白去乙酰化调控［13］。CTNNA1转染则可抑制白血病细胞增殖，促进凋亡［13］，而PTEN-C／EBPα-CTNNA1保守轴在CTNNA1表达调控中同样发挥着重要作用，CTNNA1表达下调的原代白血病细胞中存在着人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）或C／EBPα基因突变［6］；Ye等［14］发现CTNNA1启动子甲基化与骨髓增生异常综合征疾病进展相关，但迄今为止对中国人群CTNNA1表达与AML患者临床意义的研究尚不清楚。

本研究结果表明，CTNNA1表达降低在AML患者中发生频率较高，但与AML亚型和血液学参数并无相关性，且对患者的化疗效果和预后并无影响，提示CTNNA1异常可能是白血病发生过程中的一个较早期事件。本研究未能发现CTNNA1表达与5q-的相关性，可能一方面由于本组中伴5q-异常的病例数较少，另一方面可能由于CTNNA1表达改变还受启动子甲基化和组蛋白去乙酰化调控有关，这需要更多的病例进一步明确。ROC曲线分析显示，CTNNA1表达水平诊断AML的AUC为0.806，当诊断临界值设为0.11时其特异性达100%，敏感性达71%，表明CTNNA1表达对于AML具有中等诊断价值。同时，我们对4例AML患者进行了监测，发现缓解后CTNNA1表达水平较治疗前明显上升，提示CTNNA1表达可作为一个分子标志用于疾病状态的监测。

综上所述，我们的研究揭示AML患者中存在着较高频率的CTNNA1表达下调，但其对患者的治疗效果及预后并无明显影响；检测CTNNA1表达可用于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测。

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Expression of CTNNA1 gene in acutem yeloid leukem ia and its clinical significance

CHEN Xing-xing1，QIAN Jun1，LIN Jiang2，AN Cui1，MA Ji-chun2，DENG Zhao-qun2，CHEN Qin2，YANG Jing1，LIYun1，QIAN Zhen1，LIU Qing1，TANG Chun-yan1

（1.Department of Hematology，2.Department of Laboratory Center，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the expression of the human catenin alpha 1（CTNNA1）gene in acutemyeloid leukemia（AML）and its clinical significances.M ethods：The expression of CTNNA1 transcript in bonemarrow mononuclear cells from 25 controls（control group）and 92 newly diagnosed AML patients（observation group）were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）；and the relationship between CTNNA1 expression and clinical parameters were analyzed.Results：Downregulated CTNNA1 expression was found in 51 AML cases（55.43%），significantly lower than that in all25 controls（P＜0.001）.There was no correlation between The CTNNA1 expression level and the sex，age，blood parameters and FAB subtypes（both P＞0.05）.ROC curve analysis revealed that the CTNNA1 expression level could discriminate AML patients from controls effectively（AUC＝0.806）.There was no statistical difference in the complete remission rate between control group and observation group，though the patients with low CTNNA1 expression in observation group had higher complete remission rate after chemotherapy（χ2＝2.476，P＝0.142）.The CTNNA1 expression levels of four patients in the observation group all increased after complete remission.Conclusion：The decreased-expression of CTNNA1 genemay be a commonmolecular e-vent in AML；and detecting its expression could be used for auxiliary diagnosis and monitoring disease.

CTNNA1；acutemyeloid leukemia；gene expression

R733.71

A

1671－7783（2014）01－0052－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130152

国家自然科学基金资助项目（81270630，81172592）；江苏省科技厅临床医学科技专项课题（BL2012056）；江苏省“333工程”科研项目资助计划（BRA2011085）；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXLX12＿0673）；镇江市科技基础设施计划项目（SS2012003）；镇江市医学重点人才、镇江市社会发展项目（SH2011056）

陈星星（1989—），女，硕士研究生；钱军（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：qianjun0007＠sina.com

2013－07－06 ［编辑］刘星星