靶向miR-126慢病毒表达载体的构建及意义

杨学艺，卢小东，邵启祥，刘家秀，刘娟

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.淮阴卫生高等职业技术学校检验药学系，江苏淮安223300；3.淮安市第四人民医院检验科，江苏淮安223001）

靶向miR-126慢病毒表达载体的构建及意义

杨学艺1，2，卢小东1，邵启祥1，刘家秀2，刘娟3

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.淮阴卫生高等职业技术学校检验药学系，江苏淮安223300；3.淮安市第四人民医院检验科，江苏淮安223001）

目的：检测微小RNA-126（microRNA-126，miR-126）在CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）中的表达水平，同时构建基于慢病毒的miR-126反义寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表达载体。方法：实时定量PCR特异性探针法检测miR-126在Tregs中的表达水平；针对miR-126序列，设计合成其ASOs序列，退火后连接至经AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶双酶切的pGCsil-LV-GFP载体上，连接产物转化DH5α感受态细胞，对经PCR鉴定为阳性的载体（命名为pGCsil-miR-126-ASOs）进行测序分析；将构建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表达质粒和pHelper 1.0、pHelper 2.0质粒共转染293T细胞，浓缩病毒颗粒并测定所获病毒滴度；将制备好的病毒颗粒感染经TGF-β体外诱导培养的小鼠CD4＋CD62L＋初始T细胞，72 h后用流式细胞仪检测其Foxp3的表达变化。结果：实时定量PCR结果显示miR-126在CD4＋CD25＋Tregs中的表达明显高于CD4＋CD25－T细胞（P＜0.01）；测序结果证明成功构建pGCsil-miR-126-ASOs重组质粒载体，包装并获得高浓度的慢病毒颗粒，病毒滴度为9×108TU／m L；重组的病毒能明显抑制Tregs的外周诱导（P＜0.05）。结论：成功构建miR-126 ASOs的慢病毒表达载体，并获得高浓度的病毒颗粒。

微小RNA-126；CD4＋CD25＋调节性T细胞；反义寡核苷酸；慢病毒

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一组内源性、长度在22～24 nt的非编码单链小RNA分子，能在转录后水平通过促进靶mRNA的降解或抑制蛋白质翻译来负调控靶基因的表达，从而参与调控细胞的发育、分化和功能［1－2］。近年来大量研究显示，T细胞亚群具有不同的miRNAs表达谱，后者在不同亚群T细胞的发育、分化和功能维持中发挥了关键的调控作用［3－4］。

CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cell，Tregs）是一群具有负向免疫调控抑制功能的CD4＋T细胞亚群，在维持机体免疫稳定的过程中发挥重要作用，其与其他亚群之间的失衡常常导致肿瘤的免疫逃逸、免疫耐受的打破和自身免疫性疾病的发生、发展［5］。外周血中的Tregs分为胸腺发育产生的nTregs（natural Tregs）和经诱导产生的iTregs（induced Tregs）两类。体内微环境诱导产生的iTregs在临床疾病如感染性疾病和肿瘤等发生过程中发挥重要作用，然而其诱导机制仍不明确。新近的研究表明，miRNAs与Tregs的发育和功能密切相关［6］。因此，分析特定的miRNAs分子与Tregs之间的关系将有助于揭示Tregs在外周微环境中被诱导的机制。

miR-126是近年来报道的miRNAs家族成员之一，在包括肿瘤在内的多种临床疾病发生中发挥了重要作用［7］。新近的研究显示，miR-126对于CD4＋T细胞的功能起了关键的调控作用［8］，然而，还未有报道其是否参与Tregs的外周诱导过程的研究。本研究拟先检测Tregs中miR-126的表达水平，然后构建基于慢病毒的miR-126反义寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表达载体，并初步观察miR-126 ASOs是否影响Tregs的外周诱导，以期为后续深入探讨特定miRNAs分子在Tregs外周诱导过程中的作用及机制提供前期实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

慢病毒载体系统包括pGCsil-LV-GFP载体、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体（GeneChem公司）；AgeⅠ、Eco RⅠ、T4DNA连接酶（美国NEB公司）；DH5α感受态细胞（本室保存），质粒抽提试剂盒（美国Promega公司），琼脂糖凝胶回收试剂盒（碧云天生物技术公司），RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（北京索莱宝科技公司），鼠Tregs、CD4＋CD62L＋初始T细胞磁珠分选试剂盒（美国Miltenyi Biontec公司），PCR试剂（TaKaRa公司），LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），流式抗体（eBioscience公司），LightCycler定量PCR仪（Roche公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），Gel DocTMXR＋凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-126的表达

MACS磁珠法分选BALB／c小鼠脾脏Tregs和CD4＋CD25－T（conventional T cell，Tcon）细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA；用miR-126特异性发夹状引物按试剂盒说明书操作应用LightCycler定量PCR仪对两群细胞miR-126成熟体进行定量检测，PCR反应条件按试剂盒说明书操作。在扩增结束后将扩增产物进行2%凝胶电泳分析，以确定扩增产物的特异性和灵敏度。miR-126成熟体目的基因相对表达水平＝特异基因的DNA含量／内参GAPDH的含量。

1.3 靶向miR-126 RNA反义寡核苷酸序列的设计和合成

通过miRBase数据库查询到miR-126（MIMAT0000137）序列为5′-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3′，设计相应的反义寡核苷酸序列，正义链：CCGGCGCGTACCAAAAGTAATAATGTTTTTG；反义链：AATTCAAAAACATTATTACTTTTGGTACGCG；上下游序列分别含有AgeⅠ和Eco RⅠ酶切位点。将合成的正义链、反义链溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15 min，自然冷却进行退火反应形成双链的DNA插入片段。

1.4 重组慢病毒载体的构建

将退火形成的双链DNA插入片段和经AgeⅠ和Eco RⅠ酶切后线性化的pGCsil-LV-GFP质粒在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，转化氯化钙法新鲜制备的DH5α感受态细胞，菌液涂布在氨苄西林抗性的LB培养平皿，培养12 h，筛选阳性克隆并进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆送美季生物公司测序分析；菌落PCR及测序引物由捷瑞生物公司合成，上游：5′-GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3′；下游：5′-AATTCAAAAACATTATTACTTTTGGTACGCG-3′。将构建正确的质粒命名为pGCsil-miR-126-ASOs。

1.5 慢病毒颗粒的制备

调整293T细胞密度为1.2×107／mL，接种于20 cm培养皿，37℃，5%CO2全湿度培养24 h，待细胞汇合度达70%～80%时，将pGCsil-miR-126-ASOs、pHelper 1.0、pHelper 2.0 3种质粒利用LipofectamineTM2000共转染293T细胞，8 h后更换为完全培养基，培养48 h后，收集上清液，于4℃，4000×g离心10 min，悬液用0.45μm滤器过滤，进行浓缩处理后于－80℃保存。

1.6 有限稀释法测定病毒滴度

将100μL 293T细胞接种于96孔培养板，每孔4×104个，37℃、5%CO2全湿度培养36 h后进行病毒滴度测定。取8个无菌EP管，编为1～8号，每管中加90μL的Opti-MEM，1号管加10μL病毒颗粒，混匀后吸取10μL加入2号管混匀，依次倍比稀释至8号管，选择对应的培养孔，吸取90μL培养液，加入对应稀释的病毒颗粒90μL，放入培养箱培养，24 h后，更换为100μL完全培养基，继续培养72 h，倒置荧光显微镜下观察GFP的表达情况，根据表达GFP的293T细胞数目，计算病毒滴度。

1.7 感染CD4＋CD62L＋初始T细胞

MACS磁珠法分选CD4＋CD62L＋初始T细胞，用CD3e（2 mg／mL）抗体包被培养板，合并可溶性CD28抗体（2 mg／mL）、IL-2（100 U／mL）、TGF-β（10 ng／mL），在含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／mL链霉素、1 mmol／L L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，诱导培养24 h，按MOI＝100加入相应体积的miR-126ASOs慢病毒颗粒，37℃、5%CO2全湿度培养12 h，更换为新鲜的培养基，继续培养60 h，流式细胞术检测Foxp3的表达，同时设立3个对照组：PBS组、pGCsil-对照组、TGF-β组。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 Tregs中miR-126的表达

实时PCR特异性探针法检测Tregs和CD4＋CD25－T细胞中miR-126成熟体的表达水平，结果显示miR-126在Tregs中的表达水平明显高于CD4＋CD25－T细胞（t＝2.93，P＜0.01）。见图1。

图1 实时荧光定量PCR检测Tregs和CD4＋CD25－T细胞m iR-126的表达Fig 1 Real-time PCR analysis of expression ofm iR-126 inTregs and CD4＋CD25－T cells

2.2 pGCsil-LV-GFP载体的线性化

对pGCsil-LV-GFP载体用限制性内切酶AgeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，酶切片段大小应为7 352 bp，结果显示酶切片段大小正确（图2）。

图2 pGCsil-LV-GFP载体的线性化Fig 2 Enzyme cutting production of pGCsil-LV-GFP vector

2.3 重组质粒pGCsil-miR-126-ASOs的鉴定

线性化的pGCsil-LV-GFP载体和miR-126 ASOs插入片段的连接产物经转化，挑选出阳性克隆，进行菌液PCR。琼脂糖电泳结果显示，8个克隆中只有2号克隆为阴性，其余克隆均为阳性，且产物大小正确（274 bp）（图3）。筛选出的阳性克隆经摇菌、抽提质粒进行测序，与设计序列完全一致（图4），结果表明成功构建pGCsil-miR-126-ASOs重组质粒。

图3 阳性克隆PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the positive clone PCR product

图4 重组质粒pGCsil-m iR-126-ASOs的DNA序列Fig 4 DNA sequencing analysis of the recombinant plasm id pGCsil-m iR126-ASOs

2.4 慢病毒颗粒的包装及滴度

将pGCsil-miR-126-ASOs、pHelper 1.0和pHelper 2.0这3种质粒体外共转染293T细胞，48 h后，逐步收集培养上清。浓缩慢病毒颗粒后，采用有限稀释法感染293T细胞，倒置显微镜下观察，可见GFP的表达（图5），计数各培养孔表达GFP的阳性细胞数，计算得到病毒的滴度为9×108TU／mL。

图5 pGCsil-m iR-126-ASOs慢病毒颗粒感染293T细胞后GFP的表达（×100）Fig 5 Expression of GFP in 293T cells infected by pGCsilm iR-126-ASOs lentivirus

2.5 miR-126 ASOs对Tregs的外周诱导的抑制

按文献［9］报道建立Tregs的体外诱导体系，将表达pGCsil-miR-126-ASOs的慢病毒颗粒加入培养体系中，继续培养72 h后，流式细胞术检测Foxp3的表达。结果显示PBS组、pGCsil-对照组、TGF-β组和pGCsil-miR-126-ASOs组中CD4＋T细胞的Foxp3表达比例分别为（0.93±2.02）%、（5.94± 0.02）%、（6.01±0.04）%、（1.55±0.02）%。分析发现，与TGF-β组比较，pGCsil对照对Tregs的外周诱导未产生明显影响（t＝1.48，P＞0.05），而pGCsil-miR-126-ASOs Foxp3组的相对比率明显降低（t＝97.5，P＜0.001），见图6。

图6 m iR-126-ASOs对Tregs外周诱导的影响Fig 6 Effects ofm iR-126-ASOs on the peripheral induction of Foxp3

3 讨论

Tregs是能抑制免疫系统激活的独特T细胞功能亚群，在维持机体的免疫自稳和自身耐受中具有重要的作用。目前认为Tregs主要包括从胸腺T细胞发育分化而来的nTreg和在特定的外周微环境中，由成熟CD4＋CD25－T细胞经诱导生成的iTreg［10］。大量研究显示，iTreg在肿瘤免疫、黏膜免疫耐受和过敏性反应中均具有重要的作用［11］。因此，Tregs的外周诱导机制引起了研究者们的广泛关注。已有的研究显示，TGF-β-Smad信号途径在Tregs的外周诱导中发挥了关键作用［12－13］。然而，在TGF-β诱导Foxp3表达过程中，如果PI3K-Akt信号途径的磷酸化水平升高，则会抑制Foxp3的诱导表达，相反，提前抑制PI3K-Akt信号途径的传递，则可上调Foxp3的表达［14－15］。由此可见，PI3K-Akt信号途径在Tregs的外周诱导中也具有重要的调控作用。此外，还有研究显示IL-2或CD28分子信号途径也参与了Tregs的外周诱导过程［16－17］。然而，这些与Tregs外周诱导密切相关的关键信号途径的调控分子至今仍未阐明。

近年来，越来越多的证据显示多种miRNAs分子参与了Tregs的发育、分化和功能调节［6］。Cobb等［18］发现在Dicer－／－小鼠体内，Tregs的数量和功能明显降低。Jiang等［19］的研究也发现miR-17和miR-19b通过作用于靶基因TGFβ-RⅡ、CREB1和PTEN调节Tregs的诱导分化过程。这些研究表明，特定的miRNAs在Tregs的外周诱导和功能发挥中起了关键的调控作用。然而，由于miRNAs分子家族成员的庞大和Tregs外周诱导机制的复杂性，只有深入研究特定miRNAs分子参与调控Tregs外周诱导的作用及机制才能为Tregs外周诱导机制的阐明提供帮助。

miR-126是新近报道的miRNAs家族成员，位于鼠的2号染色体EGFL7基因7号内含子［7］。大量研究显示，miR-126在机体多种组织发育和临床疾病如肿瘤发生中起了关键的调控作用。新近的研究［8］还发现系统性红斑狼疮患者CD4＋T细胞高表达miR-126，后者通过作用于靶分子Dnmt1调控CD4＋T细胞的功能。更重要的是，miR-126是PI3K-Akt信号途径传递的重要调节分子［20］。鉴于PI3K-Akt的信号途径在Tregs外周诱导中的重要性，我们首先通过实时荧光定量PCR法检测Tregs中miR-126的表达水平。结果显示，Tregs中miR-126的表达水平明显高于CD4＋CD25－T细胞。多项研究表明，特定的miRNAs在T细胞的不同亚群中的差异表达对于T细胞的发育或功能具有重要意义。Zhou等［21］研究显示miR-150在胸腺T细胞的CD4－CD8－双阴性阶段低表达，在CD4＋CD8＋双阳性阶段和CD8＋T细胞中适度表达，而在CD4＋T细胞中则高表达，提示miR-150的这种动态的变化可能对T细胞的发育具有调控作用。Curtale等［22］发现，miR-146a在初始T细胞中低表达，而在记忆性T细胞中高表达，进一步的研究发现初始T细胞在TCR信号刺激下，能诱导miR-146a的表达，期间需要NF-κB和c-ETS的结合位点参与。此外，该研究还发现miR-146a能影响除炎症外的多种信号通路，能作为抗凋亡因子调控活化诱导的细胞死亡并作用于Fas相关死亡域蛋白，上调miR-146a的表达能削弱TCR刺激引起的AP-1（activator protein 1）和IL-2的产生。此外，微阵列技术分析表明，bic／miR-155缺失的小鼠CD4＋T细胞表现出Th2偏向的分化，进一步研究显示小鼠的c-Maf和Itk表达升高，而c-Maf和Itk是Th2细胞分化的正向调节因子，这可能是miR-155缺失小鼠出现Th2分化偏向的原因之一［23］。因此，我们推测miR-126可能参与了Tregs外周诱导的调节过程。

作为抑制目的基因表达的手段之一，反义核酸技术也是研究miRNAs功能的有效工具，该技术是通过结合特异miRNAs，阻止其与靶基因的结合，抑制后者功能的发挥［24］。为进一步探讨miR-126是否参与Tregs的外周诱导过程，我们通过分子克隆技术构建了基于慢病毒的miR-126 ASOs表达载体，测序结果表明载体构建成功。我们进一步将miR-126 ASOs表达载体和pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞，将病毒收集浓缩后，通过有限稀释法测定其滴度为9×108TU／mL。然后，我们将病毒加入Tregs的体外诱导体系中，结果显示，当miR-126被特异性ASOs抑制后，Tregs的外周诱导比例明显降低。我们推测该效应可能与miR-126被抑制后，增强了PI3K-Akt信号途径的传递，从而削弱了Tregs的诱导。然而，其具体的分子机制仍待后续研究阐明。

总之，通过本实验，我们发现Tregs高表达miR-126。更重要的是，通过构建的miR-126 ASOs慢病毒表达载体，我们发现，抑制miR-126可以有效地削弱Tregs的诱导，提示miR-126可能在Tregs外周诱导中发挥了重要作用。

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Construction of a lentiviral vectors of antisense oligonucleotide targeting on them iR-126 and its signficance

YANG Xue-yi1，2，LU Xiao-dong1，SHAO Qi-xiang1，LIU Jia-xiu2，LIU Juan3

（1.Department of School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Laboratory＆Pharmacy，Huaiyin Advanced Vocational＆Technical School Of Health，Huai′an Jiangsu 223300；3.Departmentof Laboratory Medicine，the Forth People′s Hospital of Huai′an，Huai′an Jiangsu 223002，China）

Objective：To evaluate the expression of miR-126 in human peripheral blood CD4＋CD25＋regulatory T cells（Tregs），construct a lentiviral vector of antisense oligonucleotides（ASOs）againstmiR-126.M ethods：The expression level ofmiR-126 in Tregs and CD4＋CD25－T cellswas determined by real-time PCR respectively.The ASOs againstmiR-126 were synthesized and inserted into the pGCsil-LV-GFP plasmid and constructed the pGCsil-miR-126-ASOs plasmid which was indentified by RT-PCR and DNA sequencing.Additional，pHelper 1.0，pHelper 2.0 and pGCsil-miR-126-ASOs vectors were cotransfected into 293T cells by LipofectamineTM2000.After 48 h cultrue，the supernatantwas harvested and the titer of pGCsil-miR-126-ASOs lentivirus was determined by limiting dilution analysis.Finally，CD4＋CD62L＋naïve T cellswere infected with pGCsil-miR-126-ASOs lentivirus at MOI（multiplicity of infection）＝100 and cultured in the presence of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody plus IL-2 and TGF-βfor another 72 h，the expression of Foxp3 was analyzed by flow cytometry.Results：The expression level ofmiR-126 in Tregswas significantly higher than CD4＋CD25－T cells（P＜0.01）.Furthermore，themiR-126 ASOs inhibited the induction of Tregs in vitro（P＜0.05）.Conclusion：The lentiviral vector ofmiR-126 ASOswas constructed successfully and laid the foundation for the further re- search on themiR-126 ASOs in regulation of Treg functions.

miR-126；CD4＋CD25＋regulatory T cells；antisense oligonucleotides；lentiviral vector

R392.1

A

1671－7783（2014）01－0012－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130116

杨学艺（1980—），男，硕士研究生；邵启祥（通讯作者），教授，博士研究生导师，E-mail：shao-qx＠mail.ujs.edu.cn

2013－05－31 ［编辑］陈海林