刺参黏多糖抑制胰腺癌SW1990细胞增殖的机制研究

孙菲 李晓宇 张翠萍 徐永红 武军 单信芝 赵坤 田字彬

刺参酸性黏多糖(stichopus japonieus acidic mucopolysaccharide，SJAMP)是由刺参体壁提取的一种动物酸性黏多糖，它可以通过抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[1-2]。本研究组曾报道[3]，刺参黏多糖呈时间、剂量依赖性抑制胰腺癌细胞的增殖，诱导其凋亡，但具体机制不明。Hippo信号通路参与调控器官大小及细胞增殖和凋亡[4]，其抑癌基因失活与人类肿瘤发生密切相关[5]。本研究应用刺参黏多糖干预胰腺癌SW1990细胞，观察干预后细胞Hippo信号通路靶基因及相关基因表达的变化，探讨其在胰腺癌细胞增殖机制中的作用。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌细胞株SW1990购自青岛大学医学院附属医院中心实验室，刺参黏多糖购自中国海洋大学药学院，1640培养基购自GIBCO公司，标准胎牛血清购自杭州四季青公司，RNA提取试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司，兔抗人YAP、pYAP、GAPDH一抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗购自美国Cell Signaling公司。

二、方法

1．细胞培养：人胰腺癌细胞株SW1990常规培养、传代。取对数生长期细胞接种于6孔板中，每孔1.5×105个细胞。贴壁生长后用8 mg/ml刺参黏多糖分别干预细胞24、48、72 h，以未干预的SW1990细胞作为对照。每组设3个复孔。

2．荧光定量RT-PCR：提取各组细胞的总RNA，采用荧光定量PCR方法检测Hippo信号通路靶基因YAP、MST1、Survivin、Caspase-9、TEAD1 mRNA的表达。引物序列：YAP上游序列为3′-TGAACA-AACGTCCAGCAAGATAC-5′，下游序列为3′-CAG-CCCCCAAAATGAACAGTAG-5′；MST1上游序列为3′-AGCCGCAGTTCACGTTTACCT-5′，下游序列为3′-GATCCACCCTCTTGCCACACT-5′；Survivin上游序列为3′-GATGACGACCCCATAGAGGAAC-5′，下游序列为3′-GGGTTAATTCTTCAAACTGCTTCT-5′；Caspase-9上游序列为3′-AACAGGCAAGCAGCAAAGTT-5′，下游序列为3′-CACGGCAGAAGTTCACATTG-5′；TEAD1上游序列为3′-CAAGGTTTGAGAATGGCCGAT-5′，下游序列为3′-AAACACACAGGCCATGCAGAG-5′。内参GAPDH上游序列为3′-CACCAGGGCTGCTTTTAA-CTC-5′，下游序列为3′-TGGAAGATGGTGATGGGA-TTT-5′。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。先应用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，再行实时PCR，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。通过PCR仪自动获取Ct值，按2-△△Ct的公式计算mRNA表达量。△△Ct=(实验组目的基因平均Ct值- 实验组内参基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值)。

3．蛋白质印迹法：收集各组对数生长期细胞，提取总蛋白，采用常规蛋白质印迹法检测YAP、磷酸化YAP(pYAP) 蛋白的表达，以GAPDH为内参。兔抗人YAP、pYAP、GAPDH工作浓度1∶6 000，HRP标记的羊抗兔二抗工作浓度1∶3 000，最后ECL显色， Vilber Fusion Fx7凝胶成像仪摄取图像，Quantity One软件测定条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取均值。

三、统计学处理

结 果

一、各组SW1990细胞Hippo信号通路靶基因及相关基因mRNA表达的变化

8 mg/ml的刺参黏多糖呈时间依赖性下调YAP、TEAD1、Survivin mRNA的表达，上调Caspase-9、MST1 mRNA的表达(图1，表1)。

图1 刺参黏多糖处理24 h后SW1990细胞各基因mRNA的表达

表1 各组SW1990细胞各基因mRNA的表达量

二、各组SW1990细胞YAP、pYAP蛋白表达的变化

8 mg/ml的刺参黏多糖呈时间依赖性下调YAP蛋白的表达，但上调pYAP蛋白的表达(图2，表2)。

图2 对照组(1)及刺参黏多糖干预24(2)、48(3)、72 h(4)组SW1990细胞YAP、pYAP蛋白的表达

表2 各组SW1990细胞YAP、pYAP蛋白的表达量

讨 论

2005年Huang等首次在果蝇中发现Hippo信号通路[6]，该通路在进化过程中高度保守，参与调控细胞增殖和凋亡以及调节器官大小[4]，在细胞接触性抑制(细胞接触后改变其运动方向)乃至肿瘤的发生过程中起重要的作用[7]。Hippo通路调节异常被认为是引起癌症发生的原因之一[8]。哺乳动物的Hippo通路成员有MST、WW45、Lats、Mob1、YAP等。MST(磷酸化蛋白激酶)分为MST1和MST2两个亚型，是Hippo信号通路中抑制癌症发生的关键元件[9]。MST2 与MST1蛋白激酶结构相似度88%，二者通过磷酸化负性调控YAP水平[10]。YAP是Hippo信号通路核心效应因子，是一种候选癌基因，位于人类染色体11q22。YAP转录辅助活性取决于YAP在细胞内的位置。位于细胞核内时，它与TEAD转录激活因子一起共同促使下游转录因子Cyclin E、 DIAP1等表达增加，启动基因转录，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[11]；YAP磷酸化后转位进入胞质，胞质中的YAP通过磷酸化的ser127与14-3-3蛋白相结合而丧失作为转录辅助激活因子的功能[12]。在多种人类肿瘤中, YAP的表达以及在细胞核的定位都明显增加[13]。有研究发现Hippo-YAP通路在胰腺胚胎发育过程中起到重要作用，YAP可以维持胚胎中胰腺腺泡细胞正常分化[14]。TEAD转录因子家族对YAP导致的肿瘤细胞过度增殖和上皮间质转化(EMT)起重要作用，其中TEAD1和TEAD2与YAP关系尤为密切[15]。

刺参酸性黏多糖是由刺参体壁提取的一种动物酸性黏多糖，具有抗凝血、抗血栓、降血脂、降低血黏度、抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒及促细胞生长等作用[16]。有研究发现，刺参黏多糖可以通过抑制细胞周期因子CyclinD1和CDK4的表达而抑制宫颈癌Hela细胞增殖，通过抑制癌基因c-myc的表达来诱导Hela细胞分化[17]。它可通过抑制细胞增生并诱导凋亡来抑制人肝癌细胞HepG2的生长，通过诱导Bcl-2和nm23-H1蛋白含量的改变来发挥其抗肿瘤作用[18]。但在胰腺癌中无相关文献报道。

本研究组以往的研究发现，刺参黏多糖能抑制胰腺癌细胞的增殖，诱导其凋亡，并呈时间、剂量依赖性[3]。本实验结果显示，随着刺参黏多糖作用时间的延长， MST1 mRNA水平升高，YAP mRNA水平及蛋白表达水平均逐渐下降，而pYAP蛋白水平逐渐升高，表明刺参黏多糖能激活SW1990细胞Hippo信号通路，并促进YAP磷酸化，从而削弱了YAP作为癌基因的作用，抑制了下游基因的转录和胰腺癌细胞的增殖。

细胞凋亡主要有两种通路：一种是以Fas和TNFR为代表的死亡受体信号转导途径；另一种是以线粒体为核心的凋亡途径。伴随着线粒体膜电位的下降，线粒体内凋亡活性物质如Ca2+、细胞色素C的释放进而激活位于凋亡途径上游的Caspase-9，进一步诱导效应Caspase-3的活化，导致Caspase-3发生断裂，最终使细胞走向凋亡[19]。Survivin能直接或间接抑制Caspase依赖或Caspase非依赖的凋亡途径。Survivin与胰腺癌肿瘤大小、血管浸润、淋巴结转移有密切关系。Survivin基因沉默可以使胰腺癌细胞周期阻滞，促进细胞凋亡[20]。本研究结果显示，刺参黏多糖作用SW1990细胞后明显下调凋亡抑制基因Survivin mRNA和上调凋亡因子Caspase-9 mRNA，激发线粒体凋亡途径，从而促使胰腺癌细胞的凋亡。

综上所述，刺参黏多糖可以上调Hippo通路中主要效应因子MST的表达，使得YAP磷酸化增加，从而抑制其癌基因的作用，抑制胰腺癌细胞增殖。同时还可以抑制抑癌基因Survivin的表达，促进Caspase-9介导的细胞凋亡。这可能是刺参黏多糖对胰腺癌的抑制机制。

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