夏广辉, 沈伟健, 余可垚, 吴 斌, 张 睿, 沈崇钰,赵增运, 卞筱泓, 许激扬*
(1.中国药科大学生物化学教研室,江苏 南京210009;2.江苏出入境检验检疫局食品实验室,江苏 南京210001)
蜂蜜和蜂王浆作为主要的蜂产品,具有较高的营养和保健价值[1],市场需求较大。但在养殖过程中蜜蜂幼虫容易染上各种疾病,例如由雅氏瓦螨引起的蜂螨病。幼虫染病后就会大量的死亡,给蜂农带来巨大的经济损失,因此蜂农就会对蜂巢喷洒农药以起到预防虫病的作用。目前氟胺氰菊酯是使用最广泛的抗螨虫药,其他的农药如氟氯苯菊酯和氯氰菊酯[2-4]以及有机磷类农药蝇毒磷[5]等也有一定的使用。农药的不合理使用导致这些农药在杀灭寄生虫的同时,往往也会污染蜂产品。如果长期食用这些被农药污染的蜂产品,人们的健康将面临严重的危险[6,7]。许多国家都规定了蜂产品中杀虫剂的最大残留量(MRL),如美国环保部规定蜂蜜中的蝇毒磷的MRL要小于0.1 mg/kg,日本肯定列表规定蜂蜜中氟胺氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯苯菊酯的MRL分别为0.01、0.005、0.05 mg/kg,我国农业部也规定了蜂蜜中氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯的MRL分别为0.05、0.01 mg/kg。
目前文献中报道的用于分析这些农药的检测技术 主 要 有 GC[2,8-10]、GC-MS[11-15]、HPLC[16]、LCMS[17]等。由于色谱-质谱联用仪器的普及,GC、LC技术因样品前处理复杂、不能定性确证,在农药残留检测中的应用已经越来越少。应用LC-MS技术分析蝇毒磷时灵敏度高、选择性好,但是在分析弱极性的氟胺氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯苯菊酯等拟除虫菊酯时灵敏度较差,尤其分析氟氯苯菊酯的灵敏度很差。GC-MS技术对于农药分析具有一定的优势,尤其近几年随着对化学电离源(CI)研究的深入,发现其对带负电的化合物具有高灵敏度,且对绝大部分基质组分和柱流失均无响应[14],使得化学电离源在农药残留分析中具有很高的价值。由于本文要分析的目标物质均含有强电负性的氰基或卤族元素,因此选用负化学电离源(NCI)技术分析这些农药尤为合适。蜂王浆成分复杂,而考察王浆中农药残留的文献较少,目前尚未见有文献采用NCI技术进行蜂蜜和蜂王浆中蝇毒磷、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯残留量的检测。
标准品:蝇毒磷(coumaphos)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氟胺氰菊酯(fluvalinate)、氟氯苯菊酯(flumethrin)(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。
正己烷、乙腈(色谱纯,美国Burdick公司);乙酸乙酯(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司);氯化钠(分析纯,南京化学试剂有限公司);乙二胺-N-丙基硅烷填料(PSA)(40~60目,美国 UCT公司);C18固相萃取柱(美国Sepax公司)。
Agilent 7890A GC-5975C MS(配有CI源)(美国Agilent公司);XW-80A旋涡混匀器(上海医科大学仪器厂);KH-500B超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司);BUCHI R-200旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司);SIGMA2-16K台式离心机(德国赛多利斯公司)。
分别准确称取10 mg(精确到0.1 mg)蝇毒磷、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯标准品,置于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯溶解并定容,分别配成1 g/L的农药单标准储备液,于4℃冰箱中冷藏保存(有效期12个月)。
分别取1.0 mL农药单标准储备液于同一个10 mL容量瓶中,并用正己烷稀释至10 mL,配制成100 mg/L的混合标准储备液,依次逐级稀释成10、1、0.1 mg/L的系列标准工作液,于4℃冰箱中冷藏保存(有效期6个月)。
1.4.1 蜂蜜
称取样品5.0 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 mL水和5 g氯化钠,涡旋2 min溶解;加入25 mL乙酸乙酯,涡旋2 min;超声提取15 min,于8 000 r/min下离心,吸取上层清液;再用25 mL乙酸乙酯提取1次;合并提取液于150 mL平底烧瓶中,于40℃下旋转蒸发至干;加入1 mL正己烷溶解,转移入10 mL试管中,加入50 mg PSA,涡旋2 min,并过0.45μm有机相滤膜于进样瓶内,待GC-NCI/MS分析。
1.4.2 蜂王浆
准确称取5.0 g(精确至0.01 g)均质的王浆样品于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈-水(1∶1,v/v)混合溶剂,超声提取15 min,于8 000 r/min下离心4 min,取上清液待净化。
将C18柱安装在固相萃取装置上,依次加入4 mL正己烷-乙酸乙酯(1∶1,v/v)混合溶剂、3 mL乙腈、3 mL水进行活化;将待净化的上清液过C18柱,真空抽干;加入4 mL正己烷进行洗脱,收集洗脱液于10 mL玻璃试管中,氮气吹干;加入1 mL正己烷复溶,转移至进样瓶内,待GC-NCI/MS分析。
色谱柱:HP-5ms弹性石英毛细管柱(30 m×0.25mm×0.25μm);柱温升温程序:初始温度100℃,以20℃/min升至300℃,保持13 min。载气:高纯(纯度≥99.999%)氦气;载气流速:1.0 mL/min;进样口温度:300℃;接口温度:250℃;进样量:1μL;进样模式:不分流进样,1.50 min后开分流阀。
离子源:NCI;电离能量:174.7 eV;离子源温度:150℃;四极杆温度:150℃;溶剂延迟时间:4.20 min;反应气:高纯(纯度≥99.99%)甲烷气;数据采集模式:SIM;离子碎片信息见表1。
表1 4种农药GC-NCI/MS分析的保留时间、线性方程、相关系数、定量和定性离子Table 1 Retention times(tR),linear equations,correlation coefficients(r2),quantification ions,identification ions of the four insecticides by GC-NCI/MS
蜂蜜的主要成分有糖类、水分、有机酸类、维生素类物质等[18]。其中糖类物质约占75%以上,主要为葡萄糖和果糖,它们均为极性物质。蜂蜜中的脂溶性组分如有机酸等[19],采用乙酸乙酯提取时会进入萃取液,给农药的准确分析带来干扰。PSA可以吸附这些有机酸,本文方法加入50 mg PSA净化以消除干扰。
王浆是一类组分较复杂的蜂产品,主要成分包括水分、蛋白质、糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素等物质[20,21]。其中蛋白质约占12%~15%,且种类有12种以上,此外还有许多小肽类物质。蛋白质的表面有许多游离的羟基,这些羟基间的键合会使蛋白质形成许多囊状结构。这些囊状的蛋白质分子会包裹农药分子,从而给农药的准确定量分析带来干扰。因此王浆样品前处理中最关键的步骤就是沉降蛋白质。蛋白质的沉降剂有许多种,如强碱、强酸类的氢氧化钠、高氯酸、三氯乙酸等,但是这些强碱、强酸在使蛋白质变性的同时,也会破坏农药结构中的酯键,导致农药回收率较低(只有30%~50%)。在分析王浆中4种目标农药时,最常用的沉降剂为有机溶剂,如乙腈、二氯甲烷、氯仿等,有机溶剂沉降蛋白质的效果很好且不会破坏基质中的农药结构。由于乙腈既可以作为蛋白质沉降剂,又可作为提取溶剂,从简化操作的目的,本文选择乙腈为沉降剂。
配制50~500μg/L 5个系列浓度的混合标准溶液并按上述GC-MS条件进行测定,以农药定量离子的峰面积对质量浓度做标准曲线,得到4种农药的线性方程及相关系数,由表1可见方程的线性关系良好(相关系数均大于0.99)。
结合加标水平为10μg/kg的蜂蜜和王浆样品的总离子流(TIC)谱图,根据S/N=3和S/N=10确定检出限和定量限,蜂蜜和王浆中4种农药的检出限和定量限见表2。4种农药的LOD范围为0.12~5.0μg/kg,LOQ 为0.40~16.5μg/kg,方法的灵敏度大大低于采用其他技术如GC、GC-EI/MS、LC 和 LC-MS等的 结果[8,10,16,17],且均可 以 满足对外贸易中的检测要求。
表2 蜂蜜和王浆两种基质中4种农药的检出限和定量限Table 2 LODs and LOQs of four insecticides in honey and royal jelly
采用电子轰击电离技术分析有较高沸点的氟氯苯菊酯时,由于受到柱流失的影响,检测基线会抬高,导致检测氟氯苯菊酯的灵敏度很差,谱图中几乎看不到出峰。由于NCI不会对柱流失成分产生响应且对氟氯苯菊酯有特异的响应,因此应用NCI检测蜂蜜和王浆基质中氟氯苯菊酯的灵敏度很高。
本文测定的4种杀虫剂均含有强电负性的基团,如氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯均含有强电负性的氰基和卤族元素氟或氯,蝇毒磷含有强电负性的氯元素。由于NCI只对含电负性基团的化合物有响应,且随着电负性的增强,响应增强,因此NCI对这4种杀虫剂具有很高的选择性。而蜂蜜和王浆的基质组分无电负性,在NCI下没有响应,也不会带来干扰。如蜂蜜和王浆中10μg/kg加标样的TIC谱图(图1c和图1e)所示,目标峰附近都没有出现干扰峰。
图1 (a)0.1 mg/L4种农药混合标准溶液、(b)空白蜂蜜样品、(c)10μg/kg加标水平的蜂蜜样品、(d)空白王浆样品和(e)10μg/kg加标水平的王浆样品的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of(a)a mixed standard solution of the four insecticides(0.1 mg/L),(b)a blank honey sample,(c)a honey sample spiked with the standards at 10μg/kg,(d)a blank royal jelly sample and (e)a royal jelly sample spiked with the standards at 10μg/kg
在阴性的蜂蜜和王浆样品中分别添加10、15和20μg/kg 3个水平的混合标准溶液,按照上述提取、净化和检测步骤,每个添加水平平行测定6次。依据测得浓度和加标浓度的比值计算4种农药的平均回收率并计算RSD。
处理王浆样品时,蛋白质的沉降有时候不是很彻底,残留的蛋白质仍会包裹农药分子,再加上前处理过程中的其他因素均会导致农药的损失。本文分别采用溶剂校正曲线和萃取液校正曲线来计算加标水平为10μg/kg的王浆样品中4种农药的回收率,结果如图2所示,蝇毒磷和氯氰菊酯采用溶剂校正曲线计算得到的回收率都在50%以下,而采用萃取液校正曲线得到的结果可以达到80%以上;很显然,采用萃取液校正曲线计算王浆中4种农药的回收率更为准确,王浆中4种农药的平均回收率在78.2%~93.1%之间,且RSD≤12.2%(见表3)。
图2 采用两种校正曲线计算10μg/kg王浆样品中4种农药的回收率Fig.2 Recoveries of the four insecticides spiked in royal jelly at 10μg/kg calculated by two kinds of calibration curves
表3 3个添加水平下4种农药在蜂蜜和王浆样品中的平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and the relative standard deviations of the four insecticides spiked in honey and royal jelly at three levels(n=6)
与王浆相比,蜂蜜基质组成较为简单且前处理操作过程也较为简单,采用溶剂校正曲线计算蜂蜜中4种农药的回收率,平均回收率在79.2%~110.0%之间,且RSD≤13.1%(见表3),结果令人满意,因此在计算蜂蜜中4种农药的回收率时,采用溶剂校正曲线即可满足残留分析要求。
本文应用GC-NCI/MS技术测定了蜂蜜和王浆中的蝇毒磷、氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、氯氰菊酯的残留量。4种农药在两种基质中的LOD范围在0.12~5.0μg/kg,LOQ 为0.40~16.5μg/kg之间。在10、15、20μg/kg添加水平下,4种农药的平均回收率在78.2%~110.0%之间,且RSD均小于14%。本方法具有简单、快速、灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强等特点,可以成为检测蜂蜜、王浆中该4种农药的常规检测技术,且满足国际贸易检测要求。
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