介孔氧化铝净化－气相色谱法同时测定蔬菜、水果及茶叶中16种有机磷农药残留

胡业琴， 郗存显， 曹淑瑞， 王国民， 李贤良， 张 雷， 张云怀＊

（1.重庆大学化学化工学院，重庆400030；2.重庆出入境检验检疫局，重庆400020；3.重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆400020）

有机磷农药是广泛用于控制或消灭农业、林业病虫害的一类有机化合物，多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类化合物。有机磷农药毒性大，与有机体内乙酰胆碱酯酶活性中心结合生成磷酸化胆碱酯酶，抑制胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能紊乱，从而导致对肌体的损害。

目前常用的检测方法主要有气相色谱－质谱法（GC－MS）［1－5］、液相色谱－质谱法（LC－MS）［6－8］等。色谱法检测灵敏度高、稳定性好、选择性高及定性定量准确，但分析之前需要对样品进行净化，如采用QuEChERS技术［2，8］、液液萃取［9］、固相微萃取［10］、液相微 萃 取［11－13］、固 相 萃 取［6］、分 散 固 相 萃 取［14］等。固相萃取技术具有操作简单、价格便宜、吸附容量大、易于与检测仪器联用等优点，逐渐成为一种通用型的样品前处理技术。在影响固相萃取效率的因素中，吸附剂的选择至关重要。目前用到的吸附剂材料 有 C18、弗 罗 里 硅 土、ENVI－Carb、Carb－NH2等。但上述传统固相萃取吸附剂选择性较差，且重复使用率低，因此迫切需要开发新型固相萃取吸附剂以提高分析检测工作的水平。纳米材料的比表面积非常大，因而相对于一般的吸附材料有更大的吸附容量，是一种较为理想的吸附材料，目前已有多种金属氧化物（Al2O3、TiO2、ZrO2、CeO和SiO2）纳米粒子作为吸附材料用于萃取不同环境介质中的污染物。Rayalu等［15］从最大吸附量和吸附动力学角度考察了介孔氧化铝与普通活性氧化铝对水溶液中氟离子的吸附能力，得出介孔氧化铝的最大吸附量比普通活性氧化铝要高，介孔氧化铝去除水中氟离子的原理可归结为吸附和配位体交换的相互作用。本研究利用溶胶凝胶技术合成了介孔氧化铝材料，并以此作为固相萃取柱的吸附剂，实现待测组分检测前处理的高效富集与净化，有效去除蔬菜、水果及茶叶基质中的色素等杂质，并与气相色谱－火焰光度检测器联用，建立了蔬菜、水果及茶叶基质中16种有机磷农药的同时测定方法，可以大大提高方法的准确度和精密度，降低检出限。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

气相色谱仪，配火焰光度检测器（GC－2010，日本Shimadzu公司）；旋转蒸发仪（Laborota 4011型，德国 Heidolph公司）；冷冻离心机（3－30 K，德国Sigma公司）；漩涡混匀器（XH－B，江苏康健医药用品有限公司）；氮吹浓缩仪（N－EVAP 116，美国Organomation Associates公司）；分析天平（BS224S，德国Sartorius公司）；组织捣碎机（Laboratory Blender，美国 Waring公司）；高速匀质仪（Silent－Crusher，德国 Heidolph公司）；超声清洗仪（KQ－600DB，昆山市超声仪器有限公司）。

蔬菜、水果、茶叶购于重庆市超市。乙酸乙酯、乙腈、环己烷、丙酮（色谱纯，美国Tedia公司）；氯化钠（分析纯，重庆市川东化工有限公司）；0.22μm有机滤膜；实验用水为超纯水。

参考Yuan等［16］的合成方法，在实验室条件下合成介孔氧化铝，使用前高温焙烧4～5 h，冷却后置于干燥器内备用。称取0.5 g合成的介孔氧化铝填充固相萃取柱。16种有机磷农药见表1，其标准品纯度为99.9%，均购于德国Augburg公司，－4℃下避光贮存。

表1 16种有机磷农药标准品Table 1 Standards of the 16 organophosphorous pesticides

1.2 实验步骤

1.2.1 混合标准溶液的配制

分别准确称取适量的农药标准品，用丙酮溶解，配成1 000 mg／L的单标准储备液，用乙酸乙酯配成2 mg／L的混合标准溶液，并根据需要，用乙酸乙酯稀释成不同质量浓度的混合标准溶液，于－18℃冰箱中保存。

1.2.2 样品提取及净化

称取5.0 g样品（白菜、生菜、南瓜、洋葱、番茄、白萝卜、苹果、梨子及茶叶，精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入2 g无水氯化钠和20 mL乙酸乙酯，涡旋振荡后使其混合均匀，剧烈振荡5 min，以6 000 r／min离心5 min；将上清液转移至旋蒸瓶中，残渣用20 mL乙酸乙酯重复提取1次；合并提取液，于40℃下旋转蒸发至干，用10 mL乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）溶解。

以自制介孔氧化铝柱作为固相萃取柱，用5 mL乙酸乙酯活化，待10 mL待测样液完全流出后，再用5 mL乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）淋洗净化柱，收集全部流出液，于40℃下氮气吹干，加1 mL乙酸乙酯定容，过0.22μm滤膜，供气相色谱测定。

1.3 气相色谱条件

色谱柱：DB－1701毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；载气：氮气（纯度≥99.999%）；恒流，流量：1.2 mL／min；进样口温度：250℃；检测器温度：275℃；进样方式：不分流进样；进样量：2μL；色谱柱升温程序：初始温度70℃，保持1 min，以10℃／min升至260℃，保持5 min，再以20℃／min升至275℃，保持2 min。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.1 提取溶剂的选择

有机磷农药具有一定的极性，其残留分析中常用的提取剂有丙酮、乙腈、乙酸乙酯等。为了确保样品中有机磷农药的提取，本实验分别对上述溶剂的提取效率进行了考察。结果（见图1）表明：乙腈提取的优点是很多亲脂性化合物如蜡质物和脂肪等不被提取，但乙腈的价格较贵，毒性较强，且其沸点高以致浓缩困难，因此其使用受到较大限制；丙酮是广泛使用的提取剂，具有低毒、容易提取和过滤、价格较低等优点，但丙酮的极性强，在提取农药的同时也将大量杂质提取出来，不利于后续净化，且丙酮与水互溶，导致水相与丙酮不能完全分离，易造成提取后含有水分不利于浓缩；而乙酸乙酯毒性小，与水不互溶。本实验以乙酸乙酯为提取溶剂进行超声及振荡提取，提取液经过滤、浓缩、定容后可直接用，既能得到较高的提取效率，又能在很大程度上降低杂质对组分测定的干扰，故选取乙酸乙酯为提取溶剂。

2.1.2 洗脱剂的选择

将介孔氧化铝填充固相萃取柱用5 mL乙酸乙酯活化，将0.5 mg／L混合标准溶液过柱，分别选用10 mL乙酸乙酯、环己烷、乙腈、丙酮、乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）、乙酸乙酯－乙腈（1∶1，v／v）、乙酸乙酯－丙酮（1∶1，v／v）、乙腈－环己烷（1∶1，v／v）进行洗脱试验。结果表明，样品经单一洗脱剂淋洗后，杂质干扰大，且有部分目标成分回收率低于60%，而乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）对目标物具有较好的洗脱效果，16种目标物的回收率均能达到95%以上。故选用乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）作洗脱剂。

图1 不同提取剂提取时有机磷农药的回收率Fig.1 Recoveries of organophosphorous pesticides extracted with different extraction agents

2.1.3 洗脱体积的选择

为了确定所用乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）的洗脱体积，测定有机磷农药的洗脱曲线及其相应回收率。各种农药的洗脱曲线类似（见图2），当洗脱体积为4 mL时，可洗涤完全，故本实验选择洗脱体积为4 mL。

图2 16种有机磷农药的洗脱曲线Fig.2 Elution curves of the 16 organophosphorous pesticides

2.1.4 固相萃取柱的净化效果

与普通氧化铝相比，介孔氧化铝展现出许多优异和特殊的性能，如具有强的耐磨性、优良的电绝缘性、优异的结构性质和表面酸碱性质、高的热稳定性和化学稳定性，故被广泛应用于陶瓷、电子、吸附、催化剂、催化剂载体等［17－19］。本实验所制备的介孔氧化铝其形貌及氮气等温吸附－脱附曲线如图3所示，从中可见该样品粒径大小均匀，孔径大小约为10 nm。将制备的介孔氧化铝作为吸附剂对食品中16种有机磷农药残留进行净化，经4 mL乙酸乙酯－环己烷（1∶1，v／v）洗脱，可得到较好的净化效果。图4为样品净化前后的对比图，由此可直接观察到去除色素的效果，净化前样品的提取液颜色较深，净化后提取液澄清透明，表明合成的介孔氧化铝除色素等杂质效果良好。

图3 介孔氧化铝的扫描电镜图和氮气等温吸附－脱附曲线图Fig.3 Photograph of scanning electron microscope（SEM）and the nitrogen adsorption－desorption isotherms of the mesoporous alumina

图4 介孔氧化铝净化样品中色素的效果Fig.4 Purification effects of pigments in samples by the mesoporous alumina

对不同基质样品进行气相色谱分析，以梨和生菜样品为例，对比净化前后的色谱图可知样品基质净化前色谱图中有干扰峰，基线不稳，而净化后基线平稳，基本无干扰峰，说明合成的介孔氧化铝对所测样品具有较好的净化效果，可用于蔬菜、水果及茶叶中有机磷农药残留检测的净化。其净化机理可能因为介孔氧化铝吸附剂具有较小的孔径及较大的比表面积。

2.2 方法学考察

2.2.1 混合农药标准溶液的色谱图

将16种有机磷农药标准品配制为混合标准溶液后，采用DB－1701毛细管柱在上述色谱条件下分离16种有机磷农药混合标准溶液的色谱图见图5，得到的峰形良好，无拖尾现象，基线平稳，且均具有较高的响应值，符合定量分析的要求。

图5 16种有机磷农药标准溶液（0.2 mg／L）的色谱图Fig.5 Chromatogram of a mixed solution of the 16 organophosphorous pesticide standards（0.2 mg／L）

2.2.2 标准曲线

准确配制质量浓度分别为10、20、50、100、200、500、1 000、2 000μg／L的16种有机磷农药标准溶液。以峰面积y为纵坐标，质量浓度x（μg／L）为横坐标进行线性回归分析。结果表明，16种有机磷农药在10～2 000μg／L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997（见表2）。以3倍信噪比计算有机磷农药的检出限（LOD）为0.79～5.77μg／kg。

表2 16种有机磷农药的保留时间、回归方程、相关系数及检出限Table 2 Retention times，calibration curves，correlation coefficients（R2）and limits of detection（LODs）of the 16 organophosphorous pesticides

2.2.3 回收率与精密度

分别测定了蔬菜、水果及茶叶基质中3个添加水平（0.05、0.20、0.50 mg／kg）下16种有机磷农药的回收率，每个样品平行测定6次，16种农药的加标回收率为83.2%～103.8%，相对标准偏差为2.0%～9.9%（表略），表明该方法的精密度良好，准确度高。

2.3 实际样品测定

利用所建立的方法对蔬菜、水果及茶叶等不同基质中的16种有机磷农药残留进行了检测，样品中未检测出16种有机磷农药。

3 结论

本文建立了白菜、生菜、南瓜、洋葱、番茄、白萝卜、苹果、梨及茶叶等不同基质中16种有机磷农药残留的提取、净化及气相色谱测定方法。本方法灵敏度高、准确度高、重复性好，适用于蔬菜、水果及茶叶基质中16种有机磷农药残留量的测定。

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