固相萃取－高效液相色谱－串联质谱测定水中8种双酚－二环氧甘油醚

张海婧， 林少彬

（中国疾病预防控制中心，环境与健康相关产品安全所，北京100021）

双酚－二环氧甘油醚主要包括双酚A二缩水甘油醚（BADGE）及其衍生物双酚 A（3－氯－2－羟丙基）甘油醚（BADGE·HCl）、双酚A双（3－氯－2－羟丙基）醚（BADGE·2HCl）、双酚A（2，3－二羟丙基）甘油醚（BADGE·H2O）、双酚 A 双（2，3－二羟丙基）醚（BADGE·2H2O）、双酚 A（3－氯－2－羟丙基）（2，3－二羟丙基）醚（BADGE·HCl·H2O）和双酚F－二环氧甘油醚（BFDGE）及其衍生物双酚F双（3－氯－2－羟丙基）醚（BFDGE·2HCl）等。这类物质作为合成原料广泛用于金属管材及蓄水容器的内涂层，以避免金属与水直接接触，从而提高管材及蓄水容器的使用寿命。在与水长期接触过程中，上述双酚－二环氧甘油醚有可能溶出。自从罐装食品中有双酚－二环氧甘油醚检出以来，双酚－二环氧甘油醚的安全性越来越受到人们的关注。2005年11月18日欧盟颁布了《关于在与食品相接触的材料及物品内使用某些环氧衍生物的法规》［1］，但目前尚无饮用水中双酚－二环氧甘油醚限值的相关法规标准。国内外已有文献报道运用液相色谱－串联质谱方法测定罐装食品［2－7］和乳制品［8］中双酚－二环氧甘油醚，但尚未见同时测定水中8种双酚－二环氧甘油醚的固相萃取－液相色谱－串联质谱检测法的相关研究报道。双酚－二环氧甘油醚属于环境雌激素，具有内分泌干扰作用［9］。研究表明这一类化合物具有“三致”作用［10，11］。Wang 等［12］测定了127份尿样中的BADGE及其衍生物BADGE·H2O、BADGE·2H2O、BADGE·HCl·H2O，结果显示上述4种物质的检出率为100%，含量为1.24～9.03 ng／mL。饮用水是除食物以外的人体中另一大双酚－二环氧甘油醚来源，因此有必要建立一种灵敏、准确、快速测定水中双酚－二环氧甘油醚的方法。本研究建立了同时测定水中8种双酚－二环氧甘油醚的固相萃取－高效液相色谱－串联质谱（SPE－HPLC－MS／MS）分析方法，并对市场上常见的饮用水接触涂料浸泡水中8种双酚－二环氧甘油醚进行了测定，从而为饮用水中双酚－二环氧甘油醚的溯源和饮用水接触涂料浸泡水中双酚－二环氧甘油醚的卫生监督提供了一定的技术依据，为下一步的研究奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；API 4000质谱仪，配有电喷雾离子源和大气压化学源（美国AB公司）；Mettler AE163十万分之一分析天平（瑞士Mettler公司）；涡流振荡器（美国思博明仪器设备有限公司）；Sigma 3K15离心机（德国Sigma公司）；Supelco固相萃取装置和EVIN－18固相萃取柱（3 mL／500 mg，表面积491 m2／g，平均孔径为7.3 nm，平均粒径为52.2μm）（美国Supelco公司）；真空浓缩仪（美国Thermo公司）。

BADGE（纯度88%）和BFDGE（纯度98%）（德国 Dr.Ehrenstorfer公司）；BADGE·HCl（纯度90%）、BADGE·2HCl（纯度95%）、BADGE·H2O（纯度97%）、BADGE·2H2O（纯度97%）、BADGE·HCl·H2O（纯度95%）、BFDGE·2HCl（纯度95%）（美国Sigma公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；Millipore超纯水。

1.2 标准溶液配制

标准储备液：准确称取（10.0±0.1）mg BADGE、BADGE· HCl、BADGE·2HCl、BADGE· H2O、BADGE·2H2O、BADGE·HCl·H2O、BFDGE、BFDGE·2HCl，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得1.00 g／L的标准储备液。

混合标准溶液：分别吸取1.00 mL BADGE、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O、BADGE·2H2O、BADGE·HCl·H2O、BFDGE、BFDGE·2HCl标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得100 mg／L混合标准中间液，逐级稀释得1.00 mg／L混合标准使用液。上述标准溶液于4℃避光保存，使用时用甲醇稀释成适当浓度的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品来源

市场上常见的9类饮用水接触涂料，包括聚乙烯粉末涂料、无溶剂环氧聚酰胺涂料、无溶剂环氧陶瓷涂料、喷涂聚脲弹性体涂料、环氧陶瓷涂料、环氧聚酰胺涂料、无溶剂环氧舱式涂料、饮用水专用聚氨酯防水涂料、快速固化聚合物内衬涂料。

1.3.2 样品的制备

取10 cm×10 cm的玻璃片，洗净烘干。在玻璃片两面按照实际使用厚度涂以涂料，在干燥处自然干燥，制成涂料片。

1.3.3 浸泡水

选取两种浸泡水，一种为超纯水，另一种浸泡水按照生活饮用水输配水设备及其防护材料的安全性评价标准［13］附录A中方法配制。

1.3.4 样品浸泡

取一块涂板，用自来水将试样涂料片清洗干净，置于容积为1 L的玻璃缸中，加入浸泡水至涂板完全浸没，用锡箔纸封口。另取2个容积为1 L的玻璃缸，其中一个加入600 mL浸泡水，另一个加入10 cm×10 cm的锡箔纸后加入600 mL浸泡水，作为空白对照。上述样品在室温避光条件下浸泡（24±1）h后对浸泡水进行分析测定。

1.3.5 固相萃取

C18固相萃取柱经10 mL甲醇和10 mL水活化后备用；准确量取200 mL浸泡水于样品瓶中，用浓盐酸调节至pH＜2，控制样品以2 mL／min的流速通过C18固相萃取柱，待水样完全流出后氮气吹干40 min，然后用3.00 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至3.00 mL，振荡混匀，取1.00 mL进行HPLC－MS／MS分析。

1.4 HPLC－MS／MS测定条件

1.4.1 色谱条件

Waters Symmetry®C18色谱柱（150 mm×3.9 mm，5μm），柱温为室温。流动相A为5 mmol／L醋酸铵；B为甲醇；C为水。梯度洗脱程序：0～1 min，5%A，70%B，25%C；1～11 min，5%A，70%B～90%B，25%C～5%C；11～13 min，5%A，90%B，5%C；13～16 min，5%A，90%B～70%B，5%C～25%C；16～23 min，5%A，70%B，25%C。流速300μL／min，进样量10μL。

1.4.2 质谱条件

电喷雾（ESI）离子源；正离子多反应监测（MRM）扫描；碰撞气（CAD）：48 kPa；气帘气（CUR）：103 kPa；雾化气（GS1）：207 kPa；加热气（GS2）：207 kPa；喷雾电压（IS）：4 500 V；去溶剂温度（TEM）：450℃；扫描时间：100 ms；保留时间、监测离子、去簇电压和碰撞电压见表1。

表1 8种物质的保留时间、监测离子、去簇电压（DP）和碰撞电压（CE）Table 1 Retention times，monitoring ions，declustering potentials（DP）and collision energies（CE）of the eight bisphenol diglycidyl ethers

2 结果与讨论

2.1 HPLC－MS／MS的条件优化

2.1.1 质谱条件的优化

用甲醇将BADGE、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O、BADGE·2H2O、BADGE·HCl·H2O、BFDGE、BFDGE·2HCl的标准储备液稀释成1.00 mg／L的标准使用液，分别用针泵进样，在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的电离方式和分子离子峰。结果表明，在正离子模式下目标化合物全扫描的准分子离子［M＋NH4］﹢最理想；以目标化合物的［M＋NH4］﹢为母离子进行子离子扫描，选择丰度较高、干扰较少的两个子离子，优化CE和DP；然后用1.00 mg／L的混合标准溶液，在正离子模式下以MRM方式优化CUR等参数，结果见1.4.2节。

2.1.2 色谱条件的优化

比较了两种流动相（甲醇－水和乙腈－水）对8种物质离子化程度的影响。结果显示，使用甲醇－水溶液体系时选择离子的色谱峰形和灵敏度均优于乙腈－水溶液体系；且在流动相中加入一定比例的醋酸铵溶液，有助于消除钠盐的干扰。另外，比较了8种双酚－二环氧甘油醚在 Waters Symmetry®C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5μm）和 Waters Symmetry®C18色谱柱（150 mm×3.9 mm，5μm）上的保留行为。结果显示，在内径为2.1 mm的色谱柱上，部分物质出现双峰；而选用内径为3.9 mm的色谱柱时，8种物质在选定的流动相条件下均能够较好地保留，各物质峰形尖锐、对称，8种物质在23 min内可以较好地分离。8种物质的MRM色谱图见图1。

图1 8种双酚－二环氧甘油醚混合标准溶液的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of the 8 bisphenol diglycidyl ethers

2.2 浸泡水的选择

取1.3.3节的浸泡水，按照1.3.5节的样品前处理方法进行加标试验。结果显示，在按照文献［13］配制的浸泡水中，8种物质不能正常出峰，可能是由于浸泡水成分中的次氯酸钠影响。进一步进行该种浸泡水加次氯酸钠和不加次氯酸钠的对比试验，结果显示不加次氯酸钠的浸泡水加标后8种物质均正常出峰，而加次氯酸钠的浸泡水加标后8种物质均未出峰，如图2所示。同时还发现，工作曲线高浓度点的溶液经固相萃取后小柱中有黄色物质富集，并可以被甲醇洗脱流出。综合考虑上述实验现象，推测可能因为双酚－二环氧甘油醚结构中的羟基和氯取代基与次氯酸钠发生反应，形成某些消毒副产物，从而未能在选定的HPLC－MS／MS测定条件下出峰。因此本研究选择超纯水作为浸泡水。

2.3 固相萃取条件优化

2.3.1 固相萃取小柱的选择

本研究中的样品溶剂为水。在选择固相萃取小柱时考虑到水的极性较强，而分析的8种物质极性中等，因此选择填料为C18的固相萃取小柱即可。

2.3.2 洗脱溶剂的选择

比较了甲醇、甲醇－乙酸乙酯（1∶1，v／v）、二氯甲烷和乙酸乙酯（依次洗脱）3种有机溶剂作为洗脱溶剂的洗脱效果。结果显示，以二氯甲烷和乙酸乙酯各 2.00 mL 依 次洗脱时，BADGE、BFDGE、BADGE·H2O和BADGE·HCl的回收率偏低；而以甲醇和甲醇－乙酸乙酯（1∶1，v／v）为洗脱溶剂时，8种物质的回收率为75.1%～129%。考虑到使用甲醇－乙酸乙酯为洗脱溶剂，需要经过真空冷冻浓缩进行溶剂置换，样品前处理过程烦琐，因此本研究选择甲醇作为固相萃取洗脱溶剂。

2.3.3 洗脱溶剂体积选择

洗脱溶剂体积的选择原则是既能够保证将分析物完全洗脱下来，又尽可能用较小的洗脱体积以提高富集倍数，降低检出限，提高效率。本研究依次选择1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL甲醇进行洗脱，结果发现当甲醇的洗脱体积为3.00 mL时，所有分析物都可以完全流出，综合考虑后确定本研究中洗脱溶剂甲醇的体积为3.00 mL。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围和检出限

配制质量浓度为0、51.2、128、320、800、2 000、5 000μg／L的系列混合标准溶液，各取200μL分别加入200 mL浸泡水中，配制成0、0.05、0.13、0.32、0.80、2.00、5.00μg／L的标准工作曲线溶液，按照1.3.5节进行前处理后用 HPLC－MS／MS分析。以化合物的峰面积（y）对相应的质量浓度（x，μg／L）做外标工作曲线。采用空白样品中添加目标物的方法，以3倍信噪比确定检出限（LOD），10倍信噪比确定定量限（LOQ）。8种物质的线性方程、相关系数及方法的检出限和定量限见表2。

图2 （a）加与（b）不加次氯酸钠的浸泡水中8种物质的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of the eight bisphenol diglycidyl ethers in water（a）with or（b）without sodium hypochlorite

表2 8种目标物的线性范围、线性方程、相关系数和定量限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of the eight target compounds

由表2可以看出，8种物质在0.007～5.00 μg／L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 0，8种物质的定量限为7～91 ng／L，能够满足定量分析的基本要求。

2.4.2 回收率和精密度

在200 mL超纯水中分别添加混合标准溶液60.0 ng和300 ng，每个添加水平测定6个样品，采用1.3.5节所述样品前处理方法进行加标回收试验和精密度试验，结果见表3。8种物质在高、低两个添加水平均可得到满意的回收率（79.1%～101%）和较好的方法重复性（RSD＜12%）。

表3 8种物质的加标回收率和精密度（n＝6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the eight bisphenol diglycidyl ethers（n＝6）

2.5 样品测定

使用市场上常见的9类涂料制备了10个饮用水接触涂料样品（其中一种类型的涂料有两个颜色，所以测了两个样品）。结果显示，在所测样品中均未检出BFDGE和BFDGE·2HCl；检出微量BADGE·2H2O、BADGE·2HCl和BADGE·H2O·HCl，含量为0.02～3.28μg／L；BADGE、BADGE·H2O和BADGE·HCl检出量较高，其在快速固化聚合物内衬涂料浸泡水中的含量分别高达143、43.7和19.5μg／L。上述结果提示饮用水接触涂料中有双酚－二环氧甘油醚的溶出隐患，应引起重视。

3 结论

本文建立了水中8种双酚－二环氧甘油醚的固相萃取－HPLC－MS／MS测定方法。实际样品测定中，部分样品中有双酚－二环氧甘油醚检出，说明该方法可以用于饮用水接触涂料浸泡水中8种双酚－二环氧甘油醚的测定。目前尚未见国内外关于水中双酚－二环氧甘油醚的测定方法的报道，而本方法的定量限可达到7～91 ng／L，完全满足定量分析要求。

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