中国一肥厚型梗阻性心肌病家系MYH7基因Arg143Gln突变研究

钟海雷，李妍伸,杜彬彬,邢清和,贺 林,张彦周

(1.复旦大学生物医学研究院发育生物学与出生缺陷研究所,上海 200032; 2.郑州大学第一附属医院心内科,郑州 450052)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种以常染色体显性遗传为主要方式的遗传性心肌病，通常以左心室(或)右心室不对称肥厚、心肌纤维肥大、排列紊乱为病理特征，是青少年尤其是35岁以下运动员猝死的首要原因[1]。其中，左心室流出道在静息或应激状态下出现血流动力学梗阻的称为肥厚型梗阻性心肌病(hypertrophic obstructive cardiomyopathy,HOCM)。肥厚型心肌病的发病率约为1/500，其中50%～70%具有明显的家族聚集倾向，称之为家族性肥厚型心肌病(familial hypertrophic cardiomyopathy，FHCM)[2]。到目前为止，通过心电图、超声心动图及血流动力学检查尚不能预测心脏性猝死的发生。因上述方法只有在心肌组织出现不可逆病理改变后方可奏效，而许多患者表现为平时无症状或首发症状就是猝死，若能在早期(不可逆病理改变之前)便做出诊断，则对于发现患者并防止不可逆病理改变及猝死的发生具有重大意义[3]。通过基因检测，可以做到早期诊断该病，特异性也高达99.9%，但因目前能够找出突变基因的HCM患者仅占总HCM患者的60%～70%[4]，且发现的与HCM相关的基因至少已有14个，这些都降低了基因检测在HCM诊断上的敏感性(约为50%～70%)[5]。然而近几年全外显子组测序的出现，为HCM的诊断及研究提供了新的技术手段，在成本相对较低的情况下大大加快了研究进度[6]。因此，本文利用全外显子测序技术对一例HOCM患者进行突变位点筛查，并通过Sanger测序进行家系成员验证，以期快速找到与该家系病症相关的突变位点。

1 对象与方法

1.1 研究对象 中国河南省一肥厚型梗阻性心肌病家系(如图1所示)，其中先证者(2号)64岁，2012年起出现胸闷、呼吸困难，晕厥症状。彩超报告显示其左室壁非均匀性增厚，以室间隔为著，最厚处25 mm，室间隔突向左室流道出道，致左室流出道狭窄，内径14 mm。增厚室壁心肌回声增粗增强，搏动僵硬，余室壁波动幅度在正常范围，诊断为肥厚型梗阻性心肌病。先证者有3个儿子(3～5号)，均曾检查出有病，先证者的丈夫(1号)为正常人。HCM诊断依据WHO/国际心脏病学会和协会ISFC 1996年公布的标准：超声心动图检查室间隔或心室壁厚度≥13 mm，排除高血压主动脉瓣狭窄等其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病。本研究经复旦大学伦理委员会同意，提供外周血样本的家系成员(1～3号)均签署了知情同意书。

图1 突变家系系谱图

1. 2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用荷兰QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取该家系1～3号样本外周血白细胞中的DNA，经NanoDrop 1000和1%琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA纯度和浓度符合要求后，置于-20℃保存备用。

1.2.2 外显子测序文库制备 将3号样本的基因组DNA超声打断、纯化，根据New England Biolabs公司DNA Library Preparation Kit试剂盒说明书制备DNA文库，Qubit质检合格后与捕获探针杂交，进一步纯化后，得到外显子测序文库。

1.2.3 高通量测序及生物信息学分析 在Illumina-Hiseq2000平台上进行高通量测序，得到的原始序列文件用Fastqc软件检测数据质量，用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)程序对序列文件和人类参考基因组(hg19版)进行比对，用Genome Analysis Tool Kit (GATK)工具输出指定基因上的突变位点，并用Annovar软件对突变位点进行注释。

1.2.4 筛选的致病位点区域PCR扩增 根据全外显子组测序中找到的突变位点及基因名，结合文献报道的已知相关基因(如MYH7、MYH6、MYBPC3等)，筛选得到感兴趣的突变位点chr14:23901922 (c.G428A; p.R143Q)，在GenBank数据库上获取突变位点上下各200 bp的序列，采用在线引物设计软件Primer 3设计引物如下：上游引物序列为5’-ACTGGCAAGTCACTGCTCCT-3’；下游为5’-CTCCCTTCCTTCTCCCTCTC-3’。以1～3号样本基因组DNA为模板，PCR扩增选用50 μl的反应体系：DNA模板10 ng；2×Taq PCR Master Mix(上海莱枫生物科技有限公司)25 μl；Primer F/R(10 μM)各1μl；灭菌双蒸水补至50 μl。使用Gene Amp® 9700 PCR仪，反应程序如下：94℃解链5 min，94℃变性30 s，60.5℃复性30 s，72℃延伸30 s，重复35个循环，72℃延伸7 min，4℃存放。

1.2.5 测序分析 PCR产物纯化后均用双脱氧末端终止法进行测序(美国ABI公司3730XL测序仪)，测序单向引物与PCR扩增引物相同。

2 结 果

2.1 全外显子组测序结果分析 通过CASAVA 1.8软件获得序列文件(7.23Gb)，GATK输出突变位点原始数据大小为36.96 Mb，平均63.1的覆盖倍数，其中覆盖倍数在10倍以上的碱基平均占总数的93%，20倍以上的占总数的83%，测序效果良好。

2.2 突变位点筛查结果 结合全外显子组测序的结果及文献报道的已知与HCM相关的基因，筛选到一个位于MYH7基因第5号外显子上的非同义突变：chr14:23901922 (c.G428A; p.R143Q)。家系成员(图1中1～3号)致病位点区域PCR扩增及Sanger测序的结果显示2号患者(先证者)、3号患者(先证者大儿子)均存在Arg143Gln突变，而1号正常人(先证者丈夫)未发现该位点突变(如图2所示)。

3 讨 论

目前的研究报道指出编码β肌球蛋白重链的MYH7是肥厚型心肌病最主要的致病基因，其突变引起的HCM约占总数的30%～50%，该基因定位于14号染色体长臂区域(14q12)，其编码的β肌球蛋白分为球状头部区S1、颈部区S2和杆状尾部区，头部区S1包含ATP酶活性位点和与肌动蛋白结合位点，是肌球蛋白的重要功能区[7](图3，表1)。

图2 MYH7基因突变家系第5号外显子核苷酸编码序列428位置测序结果

图3 β肌球蛋白结构

表1不同物种MYH7部分氨基酸序列同源对比

物种氨基酸序列人YTPEVVAAYRGKKRSEA猕猴YNAEVVAAYRGKKRSEA猫YNAEVVAAYRGKKRSEA鼠YNAEVVAAYRGKKRSEA鸡YNAEVVAAYRGKKRTEV斑马鱼YNQEVVVAYRGKKRSEA

本研究在中国河南省一家系中发现的MYH7基因Arg143Gln突变正位于球状头部区，造成了带正电荷的精氨酸转换为中性的谷氨酰胺。利用Mutation tuster在线数据库进行该位点物种间同源性比对,结果显示该突变位点所编码的精氨酸在物种间高度保守(表1黑框所示),显示其重要的生物学意义。

该突变最早是2001年由东京医科齿科大学Kimura等[8]在东亚人群中进行肥厚型心肌病和扩张型心肌病基因突变研究时发现并报道。在2010年Kimura[9]认为该位点突变虽然造成了电荷变化，但不在重要功能区域，70岁以上患者的存活率在93%以上，因此将该突变位点定性为温和性突变。

我们用BLASTP找到了与MYH7编码的β肌球蛋白重链氨基酸序列同源性达到98%的4DB1蛋白结构文件，并用分子三维结构显示软件PyMOL对该蛋白进行了结构分析。与β肌球蛋白重链蛋白一样，4DB1蛋白也是由A、B两条链组成二聚体(如图4-A所示)，而Arg143位于二聚体的结合界面上，突变后可能影响二聚体的结合。而4DB1-A链局部结构显示，突变位点Arg143与ATP的距离为20A (2 nm)，超出了结合口袋范围(与ATP距离<10 A)，因此该位点不在ATP酶活性区域，与Kimura 2010年综述中的观点相符。

图4 4DB1 A 在PyMOL下视图

此外北京阜外心血管病医院的宋雷等[10]及北京协和医学院的邵春丽[11]在152例中国肥厚型心肌病患者中共发现5例Arg143Gln突变，频率较高，提示该位点是中国人中的突变热点，其中邵春丽报道的2位携带Ala26Val和Arg143Gln双杂合突变的患者出现反复黑朦或晕厥，纽约心功能为Ⅲ级，症状较Arg143Gln单突变明显严重。另外携带有Gly716Arg，Asp778Gly等恶性突变的患者临床症状更为严重，表现为高外显率、高猝死率、预后差的特点[9]。不同突变位点所致临床表型的差异性表明深入分析突变型与表型的关系对判断患者的预后以及提前给予预防性治疗措施，延缓疾病进程都具有非常重要的意义，也是开展HCM临床基因诊断和基因治疗的首要步骤。

参考文献

[1]Chien K R. Genotype, phenotype: upstairs, downstairs in the family of cardiomyopathies[J].JClinInvest, 2003, 111 (2):175-178.

[2]Arimura T, Hayashi T, Kimura A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy[J].ActaMyol, 2007, 26 (3):153-158.

[3]Seidman J G, Seidman C. The genetic basis for cardiomyopathy: from mutation identification to mechanistic paradigms[J].Cell, 2001, 104 (4):557-567.

[4]Ashrafian H, Redwood C, Blair E,etal. Hypertrophic cardiomyopathy: a paradigm for myocardial energy depletion[J].TrendsGenet, 2003, 19(5):263-268.

[5]葛均波，崔 洁. 无创检查在肥厚型心肌病诊断中的应用[J]. 国际心血管病杂志, 2011, 38(1):5-8.

[6]Biesecker L G. Exome sequencing makes medical genomics a reality[J].NatGenet, 2010, 42 (1):13-14.

[7]Morita H, Rehm H L, Menesses A,etal. Shared genetic causes of cardiac hypertrophy in children and adults[J].NEnglJMed, 2008, 358 (18):1899-1908.

[8]Kimura A, Ito-Satoh M, Hayashi T,etal. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy in Asian populations[J].JCardiol, 2001, 37(Suppl 1):139-146.

[9]Kimura A. Molecular basis of hereditary cardiomyopathy: abnormalities in calcium sensitivity, stretch response, stress response and beyond[J].JHumGenet, 2010, 55 (2):81-90.

[10]Song L, Zou Y, Wang J,etal. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy[J].ClinChimActa, 2005, 351 (1-2):209-216.

[11]邵春丽. 肥厚型心肌病的梗阻机制及基因型—表型的关联研究[D].北京：北京协和医学院，2010.