PCNA和MMP-9在食管鳞癌中的表达及其意义

程 冕，韩敏辉，王宁燕

PCNA和MMP-9在食管鳞癌中的表达及其意义

程 冕，韩敏辉，王宁燕

目的分析PCNA,MMP-9在食管鳞癌中的表达，探讨其在食管鳞癌发生发展中的意义。方法应用免疫组化方法检测PCNA,MMP-9在52例食管鳞癌和30例癌旁组织中的表达情况，并结合临床病理资料进行分析。结果PCNA,MMP-9蛋白在食管鳞癌组织中的表达率高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。PCNA的表达与食管鳞癌的分化程度，淋巴结转移有关；MMP-9的表达与食管鳞癌分化程度，肿瘤浸润程度，淋巴结转移及临床分期相关；PCNA和MMP-9表达呈正相关(P<0.05)。结论食管鳞癌组织中PCNA,MMP-9的高表达参与了肿瘤的发生发展，联合检测有助于食管鳞癌恶性生物学行为的判断和病程的评估。

食管肿瘤； 增殖细胞核抗原； 基质金属蛋白酶-9； 免疫组织化学

食管癌是一种常见的消化道肿瘤，我国是世界上食管癌发病率最高的国家，最常见的是鳞状细胞癌，其早期诊断困难，预后差[1]。细胞周期调控异常是细胞过度增值的重要原因，在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。增殖细胞核抗原(PCNA)是反映细胞增殖活性的一个重要指标[2]。细胞外基质在维持正常组织结构与功能以及细胞生长和分化过程中起重要作用，其动态平衡的失调与肿瘤细胞的侵袭，转移和复发密切相关，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是细胞外基质的降解酶。本研究采用免疫组化方法检测PCNA,MMP-9蛋白在食管鳞癌中的表达情况，以探讨其与食管癌恶性生物学行为的关系。

1 材料与方法

1.1材料 选择我院2010-2012年行食管癌根治术，且病史资料完整的52例食管癌组织标本及与其对应的癌旁标本30例。癌组织标本经HE染色证实为食管癌，癌旁组织未见肿瘤细胞。所有病例术前未进行放疗和化疗。其中男36例，女16例；年龄为38～74岁，中位年龄数为57岁。根据分化程度分为高中分化34例，低分化18例；侵犯外膜者21例，未侵犯外膜者31例；肿瘤长径≥5 cm者16例，<5 cm者36例；有淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者28例；TNM分期：Ⅰ期 5例，Ⅱ期 28例，Ⅲ期19例。鼠抗人PCNA单克隆抗体，鼠抗人MMP-9单克隆抗体，即用型快捷免疫组化Maxvision检测试剂盒，柠檬酸缓冲盐修复液均购自福州迈新公司，DAB购自sigma公司。

1.2方法 采用免疫组化快捷maxvision二步法检测癌组织及癌旁组织中PCNA.MMP-9蛋白表达情况。标本用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，切成3 μm厚，切片经63℃烤箱烘烤过夜后分别经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以后操作步骤严格按说明书进行。采用已知表达的胃癌及乳腺癌切片作阳性对照，用已知阴性反应的其他组织切片作阴性对照，PBS缓冲液代替一抗作空白对照。

1.3结果判定 MMP-9表达以胞浆中出现棕色反应为阳性，PCNA以胞核中出现棕色反应为阳性。结果参照文献[3]评分方法，选5个高倍视野，计算阳性细胞数，以阳性细胞<5%记为0分；35%≥阳性数>5%为1分；70%≥阳性数>35%为2分；阳性数>70%为3分。着色强度计分，与阴性对照同等颜色为0分，弱着色(淡棕黄色)为1分，强着色(明显棕黄色)为2分。阳性分级：以上2项相加，0-1分为(-)；2分为(±)；3分为(+)；4分为(++)；5分为(+++)。

1.4统计学方法 采用spss12.0统计软件包进行统计学分析，采用χ2及Spearman相关分析，以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1PCNA ,MMP-9在食管癌及癌旁组织的表达 PCNA蛋白在食管鳞癌中的阳性率为75% ，在癌旁组织中的阳性表达率为23.33%，两者相比差异有统计学意义，(χ2=20.620，P<0.05)。MMP-9蛋白在食管鳞癌中的阳性率为71.15% ，在癌旁组织中的阳性表达率为16.67%，两者相比差异有统计学意义(χ2=22.606，P<0.05)。见表1。

表1 PCNA和MMP-9 蛋白在食管鳞癌及癌旁组织中的表达情况(n，%)

2.2PCNA,MMP-9蛋白表达与食管鳞癌临床病例因素的关系 PCNA蛋白表达与食管癌的分化程度，有无淋巴结转移有关，分化差，有淋巴结转移的食管鳞癌PCNA阳性表达率明显高于分化好，无淋巴结转移的鳞癌，差别有统计学意义(P<0.05)；但与肿瘤大小及浸润范围关系不密切(P>0.05)。分化越差，肿瘤浸润程度越深，TNM分期越差及有淋巴结转移的食管鳞癌中MMP-9蛋白表达率越高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 PCNA和MMP-9 蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系 (n，%)

2.3食管鳞癌组织PCNA,MMP-9蛋白表达的相关性 食管鳞癌组织PCNA,MMP-9蛋白表达呈正相关(r=0.594,P<0.05)。见表3。

表3 PCNA和MMP-9在食管癌中表达的相关性 (例)

3 讨论

PCNA是一种分子量为36kD的酸性核蛋白，是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，在细胞周期中起重要调节作用，其表达随细胞周期而变化，在G1期开始上升，S期达高峰，G2至M期下降，能客观反映原发性肿瘤的恶性增殖程度，常作为测定细胞增殖水平的指标之一[2]。在许多恶性肿瘤如大肠癌，肺癌，胃癌，鼻咽癌及肝癌中，PCNA阳性表达率明显增高[4-6]。

本实验结果通过检测53例食管鳞癌，30例癌旁组织的PCNA蛋白表达发现：PCNA在食管鳞癌组织中的表达率显著高于癌旁组织，并且在分化程度越低的癌组织中，PCNA表达率越高，伴有淋巴结转移的癌组织其表达率也高于无淋巴结转移的鳞癌。说明PCNA高表达则肿瘤细胞分化差，恶性度高，易发生转移。本实验中PCNA表达强度与侵袭范围，TNM分期无关，这与一些报道不相一致[7]，这可能与选择的标本量及其病理类型构成比，还有检测方法不同有关。一般认为，表达强度越高，预后越差，本实验支持这个结论，说明PCNA表达是预测食管癌的一个有用指标，可以和传统的临床病例特征相结合，更有效地预测食管癌的预后。

实体肿瘤对周围组织发生侵袭和转移时有几个主要的环节，包括肿瘤细胞对基底膜和细胞外基质的，对间质结缔组织的侵袭，产生远处转移灶，新生血管形成等等。其中MMP-9在破坏基底膜和细胞外基质的过程中发挥着重要作用[8]。在本实验中发现食管癌组织中MMP-9蛋白表达率显著高于癌旁组织，且随着癌组织浸润深度的增加，肿瘤细胞分化程度的降低， TNM分期的恶化，癌细胞MMP-9的表达强度越强，淋巴结转移阳性组MMP-9表达率明显高于淋巴结转移阴性组。有关MMP-9的表达与食管癌临床病例特征之间的关系有一些争议。王亚飞等[9]报道MMP-9蛋白表达与纵隔淋巴结转移肿瘤浸润深度，临床分期无明显相关性。但更多国内外报道与本实验结论一致[10-11]。产生争议的原因可能与标本的选择及评价方法不同有关。通过本研究可以认为MMP-9是一种加速肿瘤浸润、转移的蛋白水解酶，其表达量的增加能加速基底膜和细胞外基质的破坏。

本研究结果显示，在食管鳞癌中PCNA和MMP-9表达呈正相关(P<0.01)。在52例食管癌标本中有31例同时检测到上述2种蛋白的表达。产生这种现象的原因是由于肿瘤细胞的增殖能力增强强从而刺激了MMP-9的表达，还是由于一个共同的因素刺激PCNA和MMP-9的表达？具体机制有待于进一步的研究。通过本研究可以预示，PCNA和MMP-9的联合检测有助于对食管鳞癌生物学行为的判断和预后的估计，有助于合理评估患者的病程，给临床治疗方案制定提供有益的参考。

[1] Enzinger PC,Mayer RJ.Esophageal cancer[J].N Engl J Med，2003，349(23):2241-2252．

[2] Cormickd M,HallPA.The complexities of proliferation cell nuclearantigen[J].Histopathology,1992,21(1):591-594.

[3] Shimizu M,Saitoh Y,Itoh H.Immunohistochemical staining of haras oncogene product in normol,benign,and malignant human pancreatic tissues[J].Human Pathol,1990,21(6):607-612.

[4] 潘志忠，万德森，张昌卿，等．大肠癌组织p53，PCNA表达与临床病例及预后的关系[J]．癌症,1999,18(5):586-587.

[5] 莫浩元，张昌卿，冯 凯，等．鼻咽癌组织中p53，PCNA表达与临床分期、VCA/IgA,EA/IgA、放射敏感性和预后的关系[J]．癌症，2004，23(11)：1551-1554.

[6] Gumurdulu D,Erdogan S,Kayaselcuk F,et al.Expression of Cox-2,PCNA,Ki-67 and p53 in gastrointestinal stromal tumors and its relationship with histopathological parameters[J].World Journal of Gastrogenterology,2007,3(1):14.

[7] 李 娜，王洪兴，杨晓煜．VEGF和PCNA在食管癌组织中的表达及其意义[J]．新乡医学院学报，2005，22(6)：562-564.

[8] Thoms V,Walter GF,Thorns C.Expression of MMP-2.MMP-7,MMP-9,MMP-10 and MMP-11 in human astrocytic and oligodendroglial gliomas[J].Anticancer Res,2003,23(5A):3937-3944.

[9] 王亚飞，祝淑钗，沈文斌，等．食管癌中MMP-9蛋白表达及其临床意义[J]．河北医科大学学报，2008，29(3)：328-332.

[10]Ohashi K,Nemoto T,Nakamura K,et al.Increased expression of matrix metalloproteinase 7 and 9 and membrane type 1-matrix metalloproteinase in esophageal squamous cell carcinomas[J].Cancer,2000,88(10):2201-2209.

[11]高冬玲，李晟磊，赵志华，等．食管鳞癌组织中RECK和MMP-9基因mRNA检测与分析[J].中国肿瘤临床，2008，35(13)：748-751.

ExpressionandsignificanceofPCNAandMMP-9inesophagealsquamouscellcarcinomas

CHENGMian,HANMin-hui,WANGNing-yan．

(TheNo. 123HospitalofthePLA,Bengbu,Anhui233015，China)

ObjectiveTo study the expression of PCNA and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinomas and validate the significance in the tumorigenesis and progression.MethodsThe expression of PCNA and MMP-9 in 52 esophageal squamous cell carcinomas tissues and 30 adjacent non-neoplastic tissus were detected with immunohistochemical maxvision method, and the results were analyzed combined with clinical pathologic data.ResultsThe positive rate of PCNA and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinomas tissues were higher than that in adjacent non-neoplastic tissus(P<0.05).The expression of PCNA was correlated with differentiation of tumor and lymphnode metastasis.The expression of MMP-9 was correlated with differentiation of tumor,lymphnode metastasis,depth of invasion and clinical TNM types.In addition,there was a positive correlation between the expression of PCNA and MMP-9(P<0.05).ConclusionThe high expression of PCNA and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinomas may play a crucial role in the tumorigenesis and progression.Combined detection may contribute to evaluation of the malignant biological behaviour and prognosis.

MMP-9; Esophageal squamous cell carcinoma; PCNA; Immunohistochemistry

解放军第123医院 九病区，安徽 蚌埠 233015

程 冕(1974-)，男，安徽宣城市人，副主任医师，研究生。

R735.1

A

1008-7044(2014)03-0213-03

2013-09-22)