DPPH法测定蒲公英不同部位抗氧化成分含量及其规律研究

许月明，张 爽，汤 强，童传旺

(芜湖职业技术学院 生物工程学院，安徽 芜湖 241003)

DPPH法测定蒲公英不同部位抗氧化成分含量及其规律研究

许月明，张 爽，汤 强，童传旺

(芜湖职业技术学院 生物工程学院，安徽 芜湖 241003)

蒲公英的抗氧化成分是目前研究的热点，文章采用DPPH法对蒲公英不同生长期、不同部位的水分和抗氧化成分高低进行了研究。研究结果表明：蒲公英水分含量和抗氧化成分之间的关联性不是很明显；同一生长期不同部位的蒲公英植株抗氧化成分含量有明显的不同；DPPH薄层的实验结果与分光光度法的结果基本一致。

蒲公英；DPPH；CH3OH提取物；自由基清除活性

0 引言

蒲公英在我国广大地区随处可见，生于田间、道旁、荒地、草地、河岸、庭园等处，来源广泛，属于典型的药食兼用植物。几千年来，我国人民经常采集蒲公英植株作为野菜食用，蒲公英富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、微量元素及维生素等，具备非常丰富的营养和保健价值；同时蒲公英植物体中含有蒲公英醇、蒲公英素、胆碱、有机酸、菊糖等成分，具有抗病原微生物、提高免疫功能、利胆保肝等功效，因而蒲公英亦是一味很好的中草药，其药用价值极高，成为研究的热点，其中抗氧化活性是重要的研究内容之一[1]。

蒲公英中的抗氧化成分属于天然自由基清除剂，它能与自由基发生反应，因而可通过与自由基反应测定其总抗氧化成分[2]。目前有多种测定抗氧化成分的方法，如：FRAP法、T-AOC法、TEAC法等[3]，大都通过测定蒲公英中的某几种抗氧化物质的活性来研究其总抗氧化成分[4]，这些方法容易遗漏其它的抗氧化物质，不够全面。故本文采用DPPH法对蒲公英中抗氧化成分活性进行研究，DPPH(C18H12N5O6)是一种以氮为中心的有机自由基，性质稳定，其CH3OH溶液呈现紫色，且在517 nm处有强烈吸收，当存在自由基清除剂时，会提供一个电子与DPPH的孤对电子进行配对，而使其褪色，褪色的程度与其接受的电子呈定量关系[5]。

1 研究方法

1.1 新鲜蒲公英样品水分测定

采集新鲜蒲公英植株，流动水冲洗表面灰尘、杂质等，沥干水分。分别取蒲公英幼苗植株中的叶、叶梗和根、蒲公英开花植株中的叶、叶梗、根、花、花梗和花托以及蒲公英结籽植株的叶、叶梗、根和籽备用。利用电子天平分别称取120～130 mg(精确至0.000 1 g)样品1份，置于5 mL的Eppendoff管(已干燥恒重)中，放入烘箱，在温度101 ℃时烘到恒重，测定水分含量。

1.2 自由基清除剂的测定

测定自由基清除率的公式为[1-(Ap-Ac)/Amax]×100%[6]。再利用浓度和自由基清除率间对应关系，求出自由基清除率为50%时样品溶液的浓度( IC50)。一般IC50值越小，则表示该样品的自由基清除活性越高。

1.2.1 Ap的测定

移液器分别吸取1 000 μL的待检测样品溶液和1 000 μL的DPPH试液，置于5 mL的Eppendoff管中，摇匀。转移于光程0.5 cm的比色皿中，平行测定2次。

1.2.2 Ac的测定

移液器分别吸取1 000 μL的待检测样品溶液和1 000 μL的CH3OH，置于5 mL的Eppendoff管中，摇匀。转移于光程0.5 cm的比色皿中，平行测定2次。

1.2.3 Amax的测定

移液器分别吸取1 000 μL的CH3OH和1 000 μL的DPPH试液，置于5 mL的Eppendoff管中，摇匀。转移于光程0.5 cm的比色皿中，平行测定2次。

1.3 自由基清除剂薄层检识分析

用点样毛细管吸取各个40 mg/mL的样品，在薄层板上点样，然后在以CHCl3∶CH3OH∶H2O=50∶50∶5的混合溶液和2 d CH3COOH的展开剂中展开。展开后，在波长254 nm的紫外光下，用数码相机记录图谱。然后，喷洒1 mg/mL的DPPH试剂，等薄层板上的DPPH试剂干燥后，用数码相机再次记录图谱。显黄色处为清除自由基成分，因为DPPH为一种稳定的自由基，能强烈吸收517 nm的长波(呈紫色)，当自由基清除剂反应后，其吸收波长蓝移(变黄色)，因此通过观察薄层板上的颜色变化可判定出提取物中自由基清除剂在薄板上的位置[7]。

2 结果与分析

2.1 蒲公英植株同一时期不同部位含水率的比较

2.1.1 蒲公英幼苗期不同部位含水率的比较

按样品水分测定方法，测定蒲公英幼苗期的不同部位(叶、叶梗、根)的含水率，结果见表1。

表1 蒲公英幼苗期不同部位含水率

由表1中的数据可见，蒲公英幼苗期的3个部位的含水率都很高，其中以叶梗部位的含水率为最高，叶次之，而根部的含水率相比较最少。

2.1.2 蒲公英开花期不同部位含水率的比较

按样品水分测定方法，测定蒲公英开花期的不同部位(叶、叶梗、根、花、花梗、花托)的含水率，结果见表2。

表2 蒲公英开花期不同部位含水率

由表2可知，叶梗的含水率最高；其次是花梗；再次之为叶与花的含水率，它们均为85.9%；紧接着为花托，其含水率是85.6%，与叶和花很接近，这表明在蒲公英开花期，在误差允许的范围内，叶、花和花托部位的水分十分接近；含水率最少的还是根部位，为83.1%。

2.1.3 蒲公英结籽期不同部位含水率的比较

按样品水分测定方法，测定蒲公英结籽期的不同部位(叶、叶梗、根、籽)的含水率，结果见表3。

表3 蒲公英结籽期不同部位含水率

由表3可知，蒲公英结籽期的不同部位(叶、叶梗、根)的含水率与幼苗期、开花期近似，但籽的含水率明显偏少。按含水率由大到小排列，发现结籽期的叶梗依然位居首位，叶次之，而根部在之后，含水率最低的是籽部位。不仅如此，籽部位的含水率与其它3个部位的含水率相比较而言，其表现的很低，仅为30.6%。

2.2 蒲公英植株幼苗期、开花期、结籽期不同部位自由基清除率的比较

2.2.1 蒲公英幼苗期不同部位自由基清除率的比较

按样品自由基清除率检测方法，测定蒲公英幼苗期的不同部位(叶、叶梗、根)的自由基清除率，结果见图1。

图1 蒲公英幼苗期不同部位自由基清除率的比较

由图1可见，蒲公英幼苗期的3个部位的IC50的大小顺序：叶<叶梗<根。根据排序可以得出蒲公英幼苗不同部位的抗氧化成分含量的高低：叶>叶梗>根。

2.2.2 蒲公英开花期不同部位自由基清除率的比较

按样品自由基清除率检测方法，测定蒲公英开花期的不同部位(叶、叶梗、根、花、花梗、花托)的自由基清除率，结果见图2。

图2 蒲公英开花期不同部位自由基清除率的比较

由图2可见，蒲公英开花期不同部位的IC50的大小顺序：花托<叶<花<叶梗<根<花梗。根据排序可以得出蒲公英开花期不同部位的抗氧化成分含量的高低：花托>叶>花>叶梗>根>花梗。

2.2.3 蒲公英结籽期不同部位自由基清除率的比较

按样品自由基清除率检测方法，测定蒲公英结籽期的不同部位(叶、叶梗、根、籽)的自由基清除率，结果见图3。

图3 蒲公英结籽期不同部位自由基清除率的比较

由图3可见，蒲公英结籽期不同部位的IC50的大小顺序：籽<叶<根<梗。根据排序可以得出蒲公英结籽期不同部位的抗氧化成分含量的高低：籽>叶>根>叶梗。

2.3 蒲公英植株不同生长期、不同部位提取物的薄层检识

按自由基清除剂薄层检识分析法，对蒲公英甲醇提取物中的清除自由基活性物质即抗氧化成分进行检验[8]。分别对不同时期不同部位的新鲜蒲公英CH3OH提取液(40 mg/mL)进行DPPH薄层试验，用点样毛细管对同一样品各点样2次，展开剂为CHCl3∶CH3OH∶H2O=50∶50∶5和2 d CH3COOH的混合溶液。未喷DPPH试剂时，在254 nm的紫外光下，用数码相机记录图谱(区域A)；喷DPPH试剂后，等其干燥，用数码相机再次记录图谱(区域B)，如图4所示。

图4 不同生长期、不同部位的蒲公英甲醇提取物的薄层图谱

如图4所示，图中的编号对应部位如下：蒲公英幼苗植株中的叶、叶梗、根依次是10～11、12、13～14；蒲公英开花植株中的叶、叶梗、根、花、花梗、花托依次是15～16、17～18、19和21、22～23、24～25、26～27；蒲公英结籽植株中的叶、叶梗、根、籽依次是2～3、4～5、6～7、8～9。

从图4中可以明显看出：蒲公英不同部位的清除自由基活性成分含量不相同。其中，在蒲公英幼苗株期，叶部位的黄色斑点最深，说明叶部位的清除自由基活性强；在蒲公英开花株期，依据图谱中的黄色斑点的深浅，可以看出清除自由基活性顺序：花托>叶>花，但花托和叶的颜色深浅相近，差别不大；在蒲公英的结籽株期，可以看到叶和籽的黄色斑点都很深，但是籽中的黄色斑点的比移值明显低于叶部位，它可能是其它物质。从总体上观察图谱，可以看出蒲公英的根部位和梗部位的黄色斑点都很浅，说明了蒲公英的根部位和梗部位的清除自由基活性成分含量都很低。这些从图谱和上述分析比较得出的结论与通过对实验所测数据进行分析得出的结论是一致的。

2.4 讨论

1)实验中主要采用分光光度法测定吸光度，从实验中获得的数据和图表可以看出，数据的线性相关性很好。但需注意以下内容：测定溶液时，要求空白溶液与供试品溶液必须澄清，不能有浑浊；暂停检测时，需打开试样箱盖，防止光电管受长时间的照射而疲劳，影响检测结果；一般供试品溶液的吸光度读数，以在0.2～0.8之间的误差较小；用擦镜纸擦净比色皿的透光面至不留斑痕。

2)实验中所获得的自由基清除率数据是平行3次的平均值，可以看出蒲公英某些部位的清除自由基活性物质很相近。

3)实验所获得的结果，可以作为参考，若需准确分析抗氧化成分变化的顺序，还需开展进一步的实验，因为蒲公英植株中的抗氧化成分含量与所处的环境如土壤、天气等有关。

3 结语

本文主要针对蒲公英不同生长期、不同部位的水分和抗氧化成分进行了检测，发现水分和抗氧化成分之间有一定的关联，但作用不是很明显。不同生长期、不同部位蒲公英提取物的自由基清除能力与样品浓度呈正相关关系。实验中还发现蒲公英的生长期对同一部位的抗氧化成分变化影响不是很大，而同一生长期不同部位的抗氧化成分变化则较为明显，尤其是叶、花、花托、籽在每个生长期中抗氧化成分都很高，与其它部位的区别十分明显。DPPH薄层的实验结果与分光光度法的结果基本一致，在薄层板上可以明显看到叶、籽、花、花托的黄色斑点较明显，说明其抗氧化成分含量较高。

[1] 葛明明,缪月英,孙丽娜,等.蒲公英根多糖的抗氧化活性研究[J].黑龙江医药科学,2014,37(2):39-41.

[2] 戎晋华,赵文英,黄巧燕,等.蒲公英抗氧化活性部位研究[J].山东农业科学,2013,(11):99-101.

[3] 陈亚琪,康海权,陈秋平,等.油茶蒲提取物的抗氧化活性[J].林业科学,2011,47(3):20-21.

[4] 梁引库.巨大型蒲公英根脂溶性成分的抗氧化活性及抑菌实验研究[J].食品工业科技,2013,34(12):153-156.

[5] 许月明,赵一龙,张爽.蒲公英抗氧化活性初步研究[J].皖西学院学报,2012,28(5):98-100.

[6] Hu Fenglin,Lu Ruili,Huang Bo,et al.Free Radical Scavenging Activity of Extracts From Fresh Leaves of Some Chinese selected Medicinal Plants[J].FITOTERAPIA,2004,75(1):14-23.

[7] 陆瑞利,胡丰林.亚热带部分常见芳香油树种鲜叶提取物清除自由基的活性研究[J].林产化学与工业,2003,(2):51-56.

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[责任编辑：寸晓非]

2014-10-03

安徽省优秀青年人才基金重点项目(2013SQRL149ZD)；安徽省高等教育振兴计划重大教学改革研究项目(2014zdjy154)；安徽省高等教育振兴计划重大教学改革研究项目(2014zdjy155)；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2014A284)；安徽省质量工程项目：食品技术人才实训中心校企合作实践教育基地(2013sjjd036)

许月明(1980-)，女，安徽庐江人，芜湖职业技术学院生物工程学院副教授，硕士。

Q946

A

1008-4657(2014)06-0048-05