卵粘蛋白的糖链解析及构效关系研究进展

付丹，马美湖，蔡朝霞，金永国，黄茜

（国家蛋品加工技术研发分中心，华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430070）

蛋白质的糖基化修饰是最广泛、最复杂、最重要的翻译后修饰之一，糖蛋白广泛分布于生命体中，有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰。糖蛋白上的糖链是重要的信息分子，承载着数倍于核酸蛋白的生物信息，因而其被认为是继核酸链与蛋白质链之后，与生命活动息息相关的第三链。鸡蛋中的卵粘蛋白就是一种糖基化程度超过30%的高分子量硫酸酯糖蛋白。1898年Eichlolz首次从鸡蛋蛋清中分离出卵粘蛋白[1]。卵粘蛋白主要分布在禽蛋蛋清中，占蛋清总蛋白质含量的2%～4%[2]，此外，在系带和卵黄膜外层中也有分布。蛋清中的卵粘蛋白与溶菌酶和其它蛋白质等形成复合物而存在[3-4]。卵粘蛋白对维持蛋清粘稠性和凝胶结构起重要作用。禽蛋贮藏过程中常会发生蛋清由粘稠状态变为稀薄水样状态的蛋清稀化现象，许多研究者认为卵粘蛋白复合物的降解有关[5-7]。

1 卵粘蛋白的分离纯化

1.1 等电点沉淀法

等电点沉淀法是目前最常用的制备卵粘蛋白的方法。主要是利用不同蛋白质等电点不同，目标蛋白质在其等电点处溶解度最低而沉淀下来，从而达到分离蛋白质的目的。等电点沉淀法主要包括蛋白质的沉淀、富集和洗涤三个步骤。由于卵粘蛋白通常与溶菌酶或其它蛋白质以复合物形式存在。溶液中的离子可通过静电屏蔽降低卵粘蛋白与其它蛋白质之间的静电相互作用。

传统方法采用高浓度KCl溶液制备卵粘蛋白，主要操作为蛋清与水以1∶3混合并搅拌，调溶液pH为6.0使卵粘蛋白沉淀出来，然后用2%KCl反复洗涤除去卵粘蛋白中的溶菌酶，最后经水洗后得到卵粘蛋白[8]。但是有研究表明KCl洗涤会造成卵粘蛋白的损失[9]。因此，Omana and Wu用NaCl代替KCl提出了两步提取法制备卵粘蛋白的新方法[10]。该法第一步用100 mM NaCl可最大限度地除去卵白蛋白，同时使卵粘蛋白沉淀出来，第二步用500 m M NaCl除去溶菌酶制得卵粘蛋白粗品。同时，他们通过比较不同浓度的CaCl2和KCl提取卵粘蛋白，证实了用KCl制得的卵粘蛋白纯度和提取率都较低[11]。表1比较了用KCl、CaCl2、NaCl制备的卵粘蛋白样品的蛋白质组成和提取率，研究数据显示，采用CaCl2或NaCl配合两步提取法能显著提高卵粘蛋白的提取率。此外，若用NaCl三步连续等电点沉淀法制卵粘蛋白，也能达到纯度和提取率较高的符合一般实验要求的卵粘蛋白[12]。

表1 KCl、CaCl2、NaCl制备的卵粘蛋白样品的蛋白质组成和提取率Table 1 Protein composition and yield of ovomucin samples prepared by KCl，CaCl2，NaCl

一般而言，金属盐的加入会不同程度地破坏蛋白质的高级结构，从而影响蛋白质生理活性，但有研究表明Mg2+不仅可以降低卵粘蛋白和溶菌酶之间的相互作用，还有助于维持蛋白质构象的稳定，使蛋白质保持良好的生物活性。Shan yuanyuan等先用50 mM CaCl2再用50 mM MgCl2制卵粘蛋白，其纯度高达（97±0.47）%，提取率为（407.95±3.62）mg/100 g 蛋清[13]，且MgCl2的加入提高了卵粘蛋白的抗鸡新城疫病毒血凝抑制活性。由于等电点沉淀法制备的卵粘蛋白多为不溶性的，因此，等电点沉析法常与超声、超滤和离心法结合使用提高蛋白溶液的溶解度[14-16]。值得一提的是即使采用相同的方法，不同研究者在不同条件下制备的卵粘蛋白的纯度和提取率也会存在差别。

等电点沉淀法制备卵粘蛋白由于成本低、方法简单、操作方便，是制备卵粘蛋白粗提物最常用的方法，同时对于实现卵粘蛋白的工业化大量生产具有十分重要的意义。

1.2 色谱法

色谱法因分离效率高，选择性好，是分离纯化生物大分子的过程中是不可缺少的方法，且常采用液相色谱。该法分离纯化卵粘蛋白最大优点是可得到纯度高且为可溶性的蛋白质；但每次操作卵粘蛋白得到的量较少，局限于实验室分析时采用。目前已运用于卵粘蛋白提纯的主要是凝胶色谱、离子交换色谱和亲和层析色谱。

1.2.1 凝胶色谱

凝胶色谱是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。与蛋清中其它蛋白质相比，卵粘蛋白的分子量很大，可使其最先洗脱下来，从而实现分离。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。Young和Gardenr采用Sepharose 4B凝胶过滤色谱从蛋清中分离卵粘蛋白，可较清楚地将卵粘蛋白与蛋清中其他蛋白质分离开来[17]。为了最大的保持卵粘蛋白的原有性质，用含1.0%SDS的Sepharose 4B可分离得到纯度较高且可溶性的卵粘蛋白[18]。Hiidenhovi等研究发现将2个Sephacryl S-400 HR串联的凝胶过滤色谱能较好地提高分离出的卵粘蛋白亚基的分辨率及分离效率[19]。

1.2.2 离子交换色谱

离子交换色谱以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物质的衍生物为载体，根据蛋白质分子在一定的pH和离子强度条件下所带电荷的差异实现分离纯化，该技术已经成功用于分离大多数水溶性蛋白质，包括水解以后的多肽乃至氨基酸。当流动相pH合适时还能维持蛋白质的生物活性[20]。Yokota等利用超声波处理溶解卵粘蛋白，再用DEAE-cellulose离子交换色谱制备具有生物活性的卵粘蛋白亚基研究卵粘蛋白抗肿瘤活性[21-22]。

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Awadé等采用凝胶渗透色谱、反相高效液相色谱和阴离子交换高效液相色谱三种方法分离纯化鸡蛋中的蛋白质，发现凝胶渗透色谱可有效地实现卵粘蛋白与溶菌酶的分离，但对鸡蛋中其它蛋白质的分离效果不佳。采用反相高效液相色谱可实现对除卵粘蛋白外的其它蛋白质的分离。阴离子交换色谱的分辨率最高且蛋白质的回收率较好，但由于卵粘蛋白在低离子强度的溶液中是不溶解的，因此不适合用阴离子交换色谱分离[23]。

1.2.3 亲和色谱

亲和色谱主要是利用生物分子与配体特异性地结合实现分离的技术。Kato等利用卵粘蛋白与溶菌酶、卵白蛋白特异性结合，采用溶菌酶-琼脂糖4B亲和色谱、卵白蛋白-琼脂糖4B亲和色谱分离纯化卵粘蛋白，发现色谱柱上的卵白蛋白不能与溶菌酶有效结合，每毫升溶菌酶-琼脂糖4B凝胶可吸附2 mg卵粘蛋白，能较好的分离出卵粘蛋白[24]。

1.3 聚乙二醇沉淀法

近年来，聚乙二醇（PEG）常被用于生物活性物质的提取中，具有维护蛋白质的生物活性、改善蛋白质溶解度，提高蛋白质产量等优势；采用聚乙二醇法沉淀蛋白质主要利用了聚乙二醇对蛋白质的空间排斥作用使得蛋白质按照其分子量从大到小依次沉淀出来达到分离效果。Geng等采用聚乙二醇沉淀法分步提取鸡蛋蛋清中的蛋白质，由于卵粘蛋白分子量最高，使得它最先被沉淀下来[25]。

2 卵粘蛋白的糖链解析

根据糖基化修饰发生的位点及糖链连接方式的不同，糖蛋白及相应糖链主要分为N-糖链和O-糖链两大类。前者是糖链与蛋白Asn-X-Thr/Ser序列中Asn残基上的-NH2相连，X为除脯氨酸以外的任意氨基酸残基；后者则是糖链与蛋白Ser/Thr残基上的-OH相连。

研究发现，卵粘蛋白由ɑ、β 2个亚基构成，亚基之间以二硫键相连[26-28]。ɑ-亚基（包括 ɑ1-、ɑ2-）含糖量相对较低，约为11%～15%（质量比）；β-亚基含糖量相对较高，约为50%～57%（质量比），它们的平均相对分子质量分别为220 kDa、400 kDa。ɑ-亚基主要含酸性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸，β-亚基主要含羟基氨基酸如苏氨酸、丝氨酸。糖链上的低聚糖有己糖（甘露糖、半乳糖）、氨基己糖（N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺）、N-乙酰神经氨酸和硫酸酯。

卵粘蛋白作为一种与凝胶形成有关的蛋白质与生物体内粘蛋白在遗传上有一定的联系：β-亚基的编码基因与人MUC6具有同源性[29]，而ɑ-亚基包含2 087个氨基酸序列，该亚基由N-端、高度糖基化的中心区域及C-端3部分构成，对应的氨基酸序列为D1-D2-D’-D3-R-D4-C1-CK（CK 为胱氨酸结），其 N-端氨基酸序列与hpp-vWF基因区域（human pre-pro-von Willebrand factor）和人体MUC2基因同源度分别为33%、41%；C-端则分别为 30%、38%[30]。

由于糖蛋白生物合成的非模板性和结构的微不均一性，使糖蛋白具有更多的分支结构、连接方式和空间构象，目前阶段还不能在完整糖蛋白的水平上对糖链的详细结构进行研究，而需先从多肽骨架上释放寡糖链，再进一步研究寡糖链的结构特点。鉴于此，现阶段对糖链结构研究并不多。Strecker等对鸡蛋中的卵粘蛋白经碱性硼氢化钠的β消去反应释放O-糖链，经乙醇洗脱分离纯化后得到三个主要低聚糖醇OL-1，OL-2和OL-3，用FAB-MS和1H-NMR分析其结构。OL-1 结构为：Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcolβ1-3Gal；OL-2 结 构 为 Galβ1-4Glc （6-O-SO3H）NAcβ1-6GalNAc-olβ1-3Gal，OL-3 结构为 Galβ1-4Glc（6-O-SO3H）NAcβ1-6GalNAc-olβ1-3Galɑ2-3NeuAc[31]。

单媛媛等采用傅里叶变换红外光谱和二维红外相关分析研究温度变化对卵粘蛋白构象的影响时发现糖链构象对温度的耐受能力比肽链低，糖链分子的存在有利于维持蛋白构象的稳定。卵粘蛋白从25℃升温至95℃或100℃加热过程，蛋白分子链的构象发生相应的变化，在达到55℃～65℃时的改变较大。热处理过程中，卵粘蛋白的二级结构的变化次序为α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则结构[33]。

3 卵粘蛋白糖链及其构效关系

糖蛋白上的糖链就好像细胞表面的天线，在糖蛋白与病毒、肿瘤、细菌等的相互作用中起细胞识别、细胞粘附、细胞免疫等多种生理功效。卵粘蛋白构效所体现的生物活性与其糖链结构密切相关。

3.1 糖链与抗病毒侵染活性

许多病毒的囊膜表面具有能够凝集多种动物或人红细胞的血凝素，因而常用红细胞凝集评价病毒活力，用红细胞凝集抑制试验检测某特异性抗体抑制病毒的红细胞凝集能力。Gottschalk和Lind发现卵粘蛋白与猪流感病毒相互作用释放糖肽复合物可抵御猪流感病毒引起的血凝反应[33]。后来的研究发现，卵粘蛋白还对鸡新城疫病毒（NDV）、牛轮状病毒（RV）和人流感病毒（HIV）也有较高的亲和力和血凝抑制活性[34]。Shan yuanyuan等采用红细胞凝集抑制实验和酶联免疫实验也证实了卵粘蛋白与NDV的相互作用[12-13]。大量研究表明，宿主细胞表面的糖蛋白或糖脂糖链末端的唾液酸是流感病毒血凝素浸染细胞时的特异性受体。对于卵粘蛋白的抵御病毒的能力已有研究表明可能是其糖链末端的唾液酸分子发挥了重要作用[35-37]。

3.2 糖链与抗肿瘤活性

蛋白质上的糖链可以调节受体与配体间的相互作用，具有刺激肿瘤细胞的迅速增殖、介导肿瘤细胞的粘附、侵袭等重要生理功能。粘蛋白糖链的变化对于临床上鉴定各种疾病特别是肿瘤诊断有重大的意义。

E-钙粘蛋白作为一种跨膜糖蛋白，有研究表明上皮E-钙粘蛋白结合的N-糖链结构的改变和平分型N-乙酰氨基葡萄糖基糖链的增加可抑制黑色素瘤细胞的转移[39]。此后的大量研究也表明E-钙粘蛋白是一种抑癌和侵袭转移抑制的糖蛋白。此外，有人发现E-钙粘蛋白Asn633位点上的N-糖基化对E-钙粘蛋白的折叠、运输和表达具有重要作用[40]。Xia等研究O型糖基化的生物学功能时采用血管内皮细胞特异型T-synthase即C1β3Gal-T基因敲除小鼠进行实验，首次揭示了O型聚糖core 1上Galβ1-3GalNAc参与了血管新生过程[41]。

卵粘蛋白作为禽蛋中一种重要的糖蛋白，其抗肿瘤活性也备受关注，在实验室研究中，多采用酶解获得卵粘蛋白亚基或糖肽，再与肿瘤细胞作用测定卵粘蛋白的抗肿瘤活性[42-44]。本课题组左思敏等对近年来有关卵粘蛋白与肿瘤细胞的相互作用研究进行了比较全面的阐述，综述分析了卵粘蛋白抗肿瘤机制主要是抑制新生血管的生成、细胞毒效应诱导细胞凋亡和激活免疫系统等[45]。目前有关卵粘蛋白与肿瘤细胞的相互作用大多以该蛋白质的亚基片段或糖肽为主要研究对象，糖链在其中发挥的作用及作用机制还有待深入研究。

3.3 糖链与抗菌活性

已有研究表明粘蛋白具有不同程度的抗菌作用。胃粘蛋白是由上皮细胞分泌的高度糖基化和高分子量的糖蛋白，在生物体内具有保护胃壁免受化学、微生物、酶以及机械性的损伤的生理功能，同时也具有一定的抵抗幽门螺旋杆菌的能力[46]。已有研究表明粘液糖蛋白带有负电荷，由各种长度的复合低聚糖肽核心组成，互相形成胶状结构，有利于包绕细菌[47]。Kawakubo等研究显示，胃粘蛋白的中的O型糖链似乎像天然抗菌素一样具有抗幽门螺杆菌的抗菌活性，可保护宿主免受幽门螺旋杆菌侵入与感染[48]。此外，有报道称腺粘液中存在的N-乙酰葡糖胺具有抑制幽门螺旋杆菌增殖并使之变形的功能。微生物入侵宿主的第一步是粘附，大量研究表明，唾液粘蛋白的碳水化合物成分在微生物的非免疫性清除中起主要作用，唾液中粘蛋白对细菌的凝集作用而有助于细菌的清除。马玉龙等在研究肉鸡不同部位肠粘液糖蛋白与双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC 25922、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的相互作用时，发现不同细菌在不同的肠道部位均与肉鸡肠粘液糖蛋白有一定的粘附作用[49]。此外，已有研究发现糖链中 GalNAcβ1-4Gal、GalNAcβ1-3Gal、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-4GlcNAc糖单元能有效地抑制铜绿假单胞菌对粘蛋白粘附[50-51]。Schroers等研究了鲤鱼肠道粘蛋白分子量大小和糖链对其与细菌粘附性的影响时发现粘蛋白与细菌的粘附性与分子量相关，粘蛋白的糖侧链和糖骨架核心对粘附性起重要作用[52]。

Kobayashi等在研究卵粘蛋白糖肽（OPG）对食源性细菌的粘附作用时，根据生物素-亲和素-酶特异性结合，在微量滴定板中用生物素标记的病原体作为探针，用碱性磷酸酶标记亲和素测定OPG对食源性细菌（蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌O157：H7、李斯特菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）的结合能力，并采用凝集素检测细菌与OPG结合位点。研究结果显示，OPG仅与食源性大肠杆菌O157：H7作用且结合部位是糖肽上含糖区域的唾液酸[53]。同时，Ryoko等将卵粘蛋白用丝氨酸酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解，得到分子量为2.0 kDa～70.0 kDa的产物，发现这些酶解产物对食源性病原菌（肠毒性大肠杆菌、芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和假单胞菌等）具有很强的抑制作用[54]。为了评价卵粘蛋白对食品中常见的3种污染菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌）的抗菌性能，单媛媛等采用体外实验检测了卵粘蛋白抗菌活性及其稳定性，研究表明该蛋白对不同细菌的抗菌活性有较显著的差异，对大肠杆菌和沙门氏菌抑制作用较强，最小抑菌质量浓度分别为0.05 mg/mL和0.4 mg/mL，而对金黄色葡萄球菌则无明显的抑制作用。此外，研究发现不同温度和酸碱环境对卵粘蛋白抑菌稳定性也有不同的影响[55]。

3.4 其它生物活性

Sorensen等的研究则表明当MUC1粘蛋白分子上的5个O糖基化位点被糖基化时，糖肽抗原能诱发免疫反应[56]。这说明了粘蛋白的糖链参与了机体的免疫调节。

最新研究表明，卵粘蛋白经微生物蛋白酶（复合蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶）水解后得到的多肽具有良好的抗氧化作用[57]。

部分研究表明，胆结石的形成与粘蛋白有密切关系，胆汁中成核效应蛋白体系活性失衡是胆石形成的重要因素之一。成核效应蛋白大多为糖蛋白，其中糖链起着调节活性的作用。项建斌等在研究胆汁成核活性蛋白中糖链在胆石形成时发现将成核效应糖蛋白上的糖链和多肽分别酶解时该蛋白的成核活性丧失，其结果显示糖链参与成核效应蛋白的致石作用过程[58]。此外有研究表明人体中的MUC2粘蛋白是重要的促成核因子，也是参与构成胆固醇结石有机网状结构的主要蛋白之一[59]。Nagaoka等采用体外实验和Caco-2细胞模型证实空肠上皮细胞中胆固醇混合胶束与卵粘蛋白的相互作用可能抑制胆固醇的吸收，同时，卵粘蛋白也可通过抑制胆汁酸在回肠的重吸收来达到降低血清胆固醇的目的[60]。鉴于以上研究显示卵粘蛋白与胆固醇的作用也可能与其结构中的糖链有关，这有待进一步研究证实。

4 讨论与展望

由于糖蛋白中糖链序列的多样、合成的非模板性等现象的存在，使糖链的结构比蛋白质要复杂得多，因而糖蛋白糖链的解析存在一定的困难，特别是对像卵粘蛋白这样的高度糖基化同时分子量极高的粘蛋白糖链解析需要解决的问题就更多。虽然已有报道卵粘蛋白的糖与氨基酸种类及含量，但对它们的结构、空间构象等方面的解析远远不够。运用现代分析技术对卵粘蛋白的蛋白质部分和糖链部分全面的解析将为人们全面卵粘蛋白提供有力的支撑。

糖蛋白组学认为，糖蛋白的生物功能不仅与蛋白质有关，糖链也发挥了不可替代的作用。生物活性与糖链的组成及其结构密切相关。众所周知，唾液酸与发育、炎症、病原感染等诸多生理和病理过程密切相关，在人类健康和疾病中起重要作用。卵粘蛋白糖链含有相对较多的唾液酸，是否这些唾液酸具有如上功能以及发挥作用的机制等这些问题都值得研究者深入思考。此外，已有大量研究表明硫酸酯化多糖具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、降血脂等多种生理活性，对硫酸酯化多糖的生物活性的研究可为探索卵粘蛋白多种生物活性指明方向。目前已有的关于卵粘蛋白糖链在生物活性中的作用的报道并不多，因此，糖链对卵粘蛋白生物活性的影响仍将会是今后研究的一大热点。

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