针叶樱桃提取物增强小鼠细胞与体液免疫功能

钟义红，孙杰，李世芬，胡奇，秦珩，张成香，王玉邦，*，周建伟

（1.南京医科大学公共卫生学院，职业与环境卫生学系，江苏南京210029；2.南京医科大学公共卫生学院，江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，江苏南京210029）

针叶樱桃原产于西印度群岛加勒比海地区，为黄褥花科（Malpighiaceae）黄褥花属阿西罗拉种樱桃（Malpighia glabra L.），也称西印度樱桃。针叶樱桃果实的碳水化合物（35.7 mg/g～78 mg/g）、蛋白质（2.1 mg/g～8 mg/g）与脂肪（2.3 mg/g～8 mg/g）含量相对较低，富含VC（6.32mg/g～46mg/g）、膳食纤维（30mg/g），VB6（87μg/g）、以及包括玉米黄质（0.163 μg/g～0.565μg/g）、叶黄素（0.376μg/g～1.007μg/g）、α-胡萝卜素（0.078 μg/g～0.593 μg/g）、β-胡萝卜素（2.655 μg/g～16.694 μg/g）在内的类胡萝卜素成分[1-5]。由于针叶樱桃果实是L-抗坏血酸（8 mg/g～40 mg/g）含量最高的天然资源之一[4，6]，而L-抗坏血酸是VC四种异构体中生物活性最高的构型，因此，针叶樱桃冻干粉、果汁及其衍生产品一直在欧亚地区作为功能性食品销售，具有很好的抗贫血、抗真菌、抗遗传毒性与抗氧化活性，且其生物活性与果实中的L-抗坏血酸含量高低呈正相关[3，7]。

VC可以增强人类免疫功能，具有很强的抗氧化抗衰老能力，对预防癌症的发生也具有一定作用[8]，目前，国内已对针叶樱桃干粉提取物的抗氧化活性进行研究[9-10]，尚无对富含L-抗坏血酸的针叶樱桃进行免疫学研究的报道。本研究采用ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化、NK活性细胞实验、小鼠耳廓肿胀实验、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验等多种免疫功能研究方法，探讨了针叶樱桃提取物对小鼠细胞免疫、体液免疫、小鼠巨噬细胞以及NK细胞活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

针叶樱桃提取物委托南京中科药业有限公司制备提供，采用优质针叶樱桃果实干粉，以纯蒸水提取，经两次浓缩结晶纯化，活性炭脱色法去除杂质，喷雾干燥法制备，密封干燥储存。所得针叶樱桃果实提取物的VC含量≥150 mg/g，符合现有针叶樱桃食品提取工艺技术文献标准[10-11]，水分、灰分、菌落总数与重金属含量均低于食品安全国家标准相关规定。

SPF级BI/F1代健康雌性小鼠200只，体重19.0～21.9 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2008-0016，合格证号：2008001632626。

2，4-二硝基氟苯（DNFB）：中国医药（集团）上海化学试剂公司；印度墨汁：北京笃信精细制剂厂；RPMI1640培养基：GIBCOTMInvitrogen Corporation公司；ConcanvalinA（ConA）：华美生物工程公司；噻唑蓝（MTT）：韩国BIOSHARP公司；异丙醇：国药集团化学试剂有限公司。羊红细胞（SRBC）、豚鼠血清、鸡红细胞为江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心自采制备，YAC-1细胞购自上海派通生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T1000型电子天平：常熟市双杰测试厂；Spectra Max M2e多功能酶标仪：美国Molecular Devices公司；二氧化碳培养箱：美国Thermo Forma公司。

1.3 方法

1.3.1 动物实验

小鼠按体重随机分为 I、II、III、IV、V 5 个大组，每大组40只小鼠，每大组再分为4个剂量组，每个剂量组10只。I组小鼠进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化、NK细胞活性实验；II组小鼠进行耳廓肿胀实验；III组小鼠进行抗体生成细胞检测和半数溶血值HC50测定；IV组小鼠进行小鼠碳廓清实验；V组小鼠进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

受试样品的人体推荐剂量为0.70 g/人/日（以60 kg体重计），按照国标相关规定[12]，以相当于受试样品人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍，设0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d3个剂量组，另以无菌水代替受试物设0 g/kg·bw/d组为阴性对照。各剂量组受试样品及无菌水阴性对照每日1次经口给予小鼠，灌胃量0.1 mL/10 g·bw，连续灌胃 30 d。

1.3.2 ConA诱导小鼠淋巴细胞转化实验

I组连续灌胃30 d后，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾并研磨为单细胞悬液，过200目筛，以无菌Hank's液洗涤两次，1 000 r/min离心10 min收集细胞，使用RPMI1640完全培养液重悬为浓度3×106个/mL浓度的单细胞悬液，1 mL/孔接种于24孔培养板中，加入75 μL 100 μg/mL 的 ConA 液于 37℃、5%CO2培养箱中培养72 h，不加ConA液孔为对照。培养结束前4 h，每孔移除0.7 mL完全细胞培养液，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液与50 μL 5 mg/mL的MTT，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇终止反应，吹打混匀后移入96孔培养板中，每孔3个平行对照，酶标仪于570 nm下测定各样品光密度值。淋巴细胞增殖能力=加ConA的光密度值-不加ConA的光密度值。

1.3.3 NK细胞活性测定

试验方法1.3.2所制备无菌脾单细胞悬液，Hank's洗涤2次后，加入0.5 mL无菌水20秒裂解红细胞，加入0.5 mL 2×Hank's及8 mL Hank's液1 000 r/min离心10 min，使用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。取4×105个/mL浓度的YAC-1靶细胞与脾细胞各100 μL接种于96孔细胞培养板，以YAC-1细胞100 μL+培养液100 μL为YAC-1细胞自然释放孔，以 YAC-1 细胞 100 μL+2.5%Triton 100 μL 为YAC-1细胞最大释放孔，每个检测样品设三个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h。1 500 r/min离心96孔培养板5 min，每孔吸取100 μL上清，加入LDH基质液100 μL反应10 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL，于酶标仪490nm处测定光密度值。NK细胞活性（%）=（反应孔OD值-自然释放孔OD值）×100/（最大释放孔OD值-自然释放孔OD值）。

1.3.4 DNFB诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）

II组连续灌胃30 d后，剃除小鼠腹部3×3 cm鼠毛，均匀涂抹50 μL 10 mg/mL DNFB溶液致敏。5 d后以10 μL 10 mg/mL DNFB溶液均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，24 h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，以打孔器取下8 mm耳片称重。DTH程度（mg）=右耳重（mg）-左耳重（mg）。

1.3.5 抗体生成细胞检测试验

III组连续灌胃30 d后，每鼠腹腔注射2%的SRBC悬液0.2 mL进行免疫，4 d后颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾，按照1.3.2方法制备5×106个/mL脾细胞悬液。

将表层培养基与2×Hank's液1∶1混匀分装为0.5 mL每管，加入50 μL以SA缓冲液配制的10%SRBC，20 μL新鲜制备的脾细胞悬液，混匀倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，每个样品做两个平行片，于37℃、5%CO2培养箱中培养1.5 h，将新鲜豚鼠血清补体1∶8稀释后加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5 h后，计数溶血空斑数。

1.3.6 血清溶血素测定试验

试验方法1.3.4中III组小鼠腹腔注射SRBC悬液免疫4 d后，摘眼球法取血，全血静置1 h，2 000 r/min离心10 min收集血清。血清200倍稀释后，加入5%鸡红细胞悬液0.5 mL，0.5 mL补体，37℃温育30 min，离心取上清1 mL加入3 mL都氏试剂中，静置10 min后540 nm波长下测定样品管及SRBC半数溶血时的光密度值。溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，HC50=（样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值）×稀释倍数。

1.3.7 小鼠碳廓清试验

IV组小鼠连续灌胃30d后，每鼠按0.1mL/10g·bw尾静脉注射4倍稀释的印度墨汁，墨汁注入后立即计时。注射墨汁后2 min及10 min分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，加入2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用酶标仪在600 nm波长处测光密度值。吞噬指数=体重×K1/3/（肝重+脾重），K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）。

1.3.8 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

V组小鼠连续灌胃30 d后，每鼠腹腔注射1 mL 20%鸡红细胞悬液，30 min后颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注入2 mL生理盐水润洗1 min，吸出腹腔洗液于37℃恒温培养箱孵育30 min，于生理盐水中漂洗晾干，1∶1丙酮-甲醇溶液固定，4%Giemsa=磷酸缓冲液染色3 min，蒸馏水漂洗晾干，封片，光镜下观察。吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数×100/计数的巨噬细胞数，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。

1.4 数据分析

各组实验原始数据使用SPSS10.0软件进行分析，满足方差齐性的数据使用单因素方差分析中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对非正态或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，满足方差齐要求后进行t检验统计处理，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

小鼠经口给予不同剂量针叶樱桃提取物30 d后，0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d 组小鼠平均终末体重及体重增长值与0 g/kg·bw/d组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。取小鼠胸腺与脾脏计算脏体比，结果可见（表1），0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d 组与 0 g/kg·bw/d 组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 针叶樱桃提取物对小鼠胸腺、脾脏脏体比的影响（±SD）Table 1 Effects of Acerola cherry extracts on the ratio of mice thymus/spleen to body weight（±SD）

表1 针叶樱桃提取物对小鼠胸腺、脾脏脏体比的影响（±SD）Table 1 Effects of Acerola cherry extracts on the ratio of mice thymus/spleen to body weight（±SD）

剂量/（g/kg·bw/d） 样本数/n 胸腺/体重/% P值 脾脏/体重/% P值10 0.240±0.031 0.483±0.062 0.06 10 0.222±0.027 0.566 0.497±0.052 0.879 0.12 10 0.222±0.052 0.576 0.480±0.050 0.999 0.35 10 0.226±0.030 0.728 0.493±0.051 0.946 0

使用MTT法进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，结果证实（表2），0.35 g/kg·bw/d组加 ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值高于0 g/kg·bw/d组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 针叶樱桃提取物对小鼠淋巴细胞转化的影响（±SD）Table 2 Effects of Acerola cherry extracts on lymphocyte transformation in mice（±SD）

表2 针叶樱桃提取物对小鼠淋巴细胞转化的影响（±SD）Table 2 Effects of Acerola cherry extracts on lymphocyte transformation in mice（±SD）

注：a，统计学差异显著（P＜0.05）。

剂量/（g/kg·bw/d）样本数/n淋巴细胞增殖能力P值0 10 0.015±0.007 0.06 10 0.015±0.009 1.000 0.12 10 0.017±0.009 0.914 0.35 10 0.026±0.007 0.011a

采用乳酸脱氢酶测定法进行小鼠NK细胞活性测定，将NK细胞经sin-1P1/2（P为NK细胞活性）转化后进行组间 t检验比较，结果可见（表3），0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d组NK细胞活性与0 g/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 针叶樱桃提取物对小鼠NK细胞活性的影响（±SD）Table 3 Effects of Acerola cherry extracts on NK cytoactive in mice（±SD）

表3 针叶樱桃提取物对小鼠NK细胞活性的影响（±SD）Table 3 Effects of Acerola cherry extracts on NK cytoactive in mice（±SD）

剂量/（g/kg·bw/d）样本数/nNK细胞活性/%P值0 10 20.6±4.4 0.06 10 19.1±7.0 0.936 0.12 10 23.3±14.9 0.930 0.35 10 25.9±6.4 0.409

使用耳肿胀法进行DNFB诱导小鼠DTH试验，计算耳壳重量，结果可见（表4），0.35 g/kg·bw/d组耳壳增重高于 0 g/kg·bw/d组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 针叶樱桃提取物对DNFB诱导小鼠DTH的影响（±SD）Table 4 Effects of Acerola cherry extracts on DTH induced by DNFB in mice（±SD）

表4 针叶樱桃提取物对DNFB诱导小鼠DTH的影响（±SD）Table 4 Effects of Acerola cherry extracts on DTH induced by DNFB in mice（±SD）

注：a，统计学差异显著（P＜0.05）。

剂量/（g/kg·bw/d）样本数/nDTH程度/mgP值0 10 10.7±3.3 0.06 10 13.5±4.1 0.370 0.12 10 15.3±5.5 0.069 0.35 10 16.2±4.5 0.024a

采用Jerne改良玻片法进行小鼠抗体生成细胞试验，计算溶血空斑数，统计结果可见（表5），0.35 g/kg·bw/d组溶血空斑数高于0 g/kg·bw/d组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表5 针叶樱桃提取物对小鼠溶血空斑数的影响（±SD）Table 5 Effect of Acerola cherry extracts on hemolytic plaque numbers in mice（±SD）

表5 针叶樱桃提取物对小鼠溶血空斑数的影响（±SD）Table 5 Effect of Acerola cherry extracts on hemolytic plaque numbers in mice（±SD）

注：a，统计学差异显著（P＜0.05）。

剂量/（g/kg·bw/d）样本数/n溶血空斑数/（个/106脾细胞）P值0 10 41±19 0.06 10 57±18 0.215 0.12 10 56±23 0.260 0.35 10 66±22 0.027a

用半数溶血值法测定小鼠血清半数溶血值（HC50），由表 6结果可见，0.35 g/kg·bw/d组血清半数溶血值（HC50）高于0 g/kg·bw/d组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表6 针叶樱桃提取物对小鼠HC50的影响（±SD）Table 6 Effects of Acerola cherry extracts on HC50in mice（±SD）

表6 针叶樱桃提取物对小鼠HC50的影响（±SD）Table 6 Effects of Acerola cherry extracts on HC50in mice（±SD）

注：a，统计学差异显著（P＜0.05）。

剂量/（g/kg·bw/d）样本数/nHC50P值0 10 94±19 0.06 10 101±15 0.721 0.12 10 111±14 0.078 0.35 10 113±18 0.040a

小鼠碳廓清试验结果，由表7可见，0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d组小鼠吞噬指数与0 g/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表7 针叶樱桃提取物对小鼠碳廓清能力的影响（±SD）Table 7 Effects of Acerola cherry extracts on carbon clearance ability in mice（±SD）

表7 针叶樱桃提取物对小鼠碳廓清能力的影响（±SD）Table 7 Effects of Acerola cherry extracts on carbon clearance ability in mice（±SD）

剂量/（g/kg·bw/d）样本数/n吞噬指数P值0 10 5.22±0.65 0.06 10 5.53±1.56 0.831 0.12 10 5.62±0.51 0.695 0.35 10 5.73±0.95 0.528

用半体内法进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验，计算吞噬指数及吞噬百分率，并将吞噬百分率经sin-1P1/2（P为吞噬百分率）转化后进行组间t检验比较，由表 8 结果可见，0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d 组小鼠吞噬百分率与吞噬指数与0 g/kg·bw/d组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表8 针叶樱桃提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率及吞噬指数的影响（±SD）Table 8 Effects of Acerola cherry extracts on phagocytosis ratio and phagocytic count of mouse peritoneal macrophages（±SD）

表8 针叶樱桃提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率及吞噬指数的影响（±SD）Table 8 Effects of Acerola cherry extracts on phagocytosis ratio and phagocytic count of mouse peritoneal macrophages（±SD）

/（g/kg·bw/d）样本数/n吞噬百分率/% P值 吞噬指数 P值剂量10 21.2±2.3 0.26±0.02 0.06 10 21.5±3.8 0.995 0.28±0.05 0.673 0.12 10 22.3±2.5 0.722 0.29±0.03 0.208 0.35 10 23.3±2.5 0.255 0.29±0.04 0.134 0

3 结论

针叶樱桃提取物以 0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d 连续给样一个月，没有对小鼠的摄食、体重增长、主要免疫器官的脏体比产生影响（P＞0.05）。免疫功能研究结果显示，在细胞免疫方面，0.35 g/kg·bw/d组与0 g/kg·bw/d组相比，在ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验与DNFB诱导的小鼠DTH实验中，针叶樱桃提取物显著增强小鼠的脾细胞免疫功能（P＜0.05）；在体液免疫功能方面，针叶樱桃提取物的抗体生成细胞检测实验与血清半数溶血值实验中，0.35 g/kg·bw/d组溶血空斑数与血清半数溶血值高于0 g/kg·bw/d组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而在单核-巨噬细胞功能与NK细胞活性实验中，0.06、0.12、0.35 g/kg·bw/d 组与 0 g/kg·bw/d组相比，吞噬指数、吞噬百分率以及NK细胞活性结果均未见统计学差异（P＞0.05）。综上所述，针叶樱桃提取物可以有效增强小鼠的细胞与体液免疫功能，但在增强巨噬细胞与NK细胞活性方面，生物活性并不显著。

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