黑曲霉产植酸酶发酵工艺优化

李海燕，王志，2，陈雄，2，*，付刚

（1.湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉430068；2.发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉430068；3.潍坊盛泰药业有限公司，山东昌乐262400）

植酸酶（Phytase）是一类水解植酸的磷酸酶类，在动物、植物、微生物中均有发现，其主要来源是微生物源植酸酶。自然界有许多微生物都能产生植酸酶，如细菌、酵母和丝状真菌等，特别是曲霉菌属微生物，如黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉等都能产生活性较高的植酸酶[1]。微生物来源的植酸酶与其他来源的相比较具有来源广、生产周期短、pH耐受范围大等优点，因而优化培养条件和工艺、进一步提高产量，成为微生物发酵产植酸酶研究的热点。

目前植酸酶在饲料中应用比较广泛，植酸酶可以降解植酸盐蛋白质络合物，提高动物对蛋白质的利用，从而减少植酸盐对微量元素的螯合，提高饲料的营养价值，另一方面可以降低粪便中的磷含量，减少环境污染[2-6]。

本文以黑曲霉为底物，利用液态发酵，探索了不同工艺条件对黑曲霉发酵产植酸酶的影响，筛选了最佳工艺条件，为大规模发酵生产廉价的植酸酶制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger）：湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室保藏。

1.1.2 培养基

活化培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL。

种子培养基：麸皮2 g，葡萄糖3 g，硫酸铵0.15 g，去离子水100 mL。

摇瓶培养基：蛋白胨1.0 g，葡萄糖60.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MnSO40.01 g，吐温-80 2.0 mL，溶于 1 000 mL 去离子水中。

优化培养基：详见实验方法。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 活化培养

将黑曲霉菌种，接种到PDA斜面培养基上，26℃下培养5 d。

1.2.1.2 种子培养

按配方配制种子培养基，在250 mL三角瓶中装100 mL，115℃灭菌30 min，从上述活化的斜面培养基上刮取几环孢子集中到种子培养液中，在30℃下，220 r/min培养36 h。

1.2.1.3 培养基优化研究

运用正交试验理论对发酵培养基进行优化，采用六因素五水平的方法，设计出如表1培养基配方。正交实验培养条件：培养基初始pH自然，接种量10%，培养温度28℃，摇床转速300 r/min。

表1 黑曲霉培养基优化正交试验方案Table 1 Medium optimization of Aspergillus niger with orthogonal experimental program

1.2.1.4 发酵条件优化研究

在上述实验中确定的最佳培养基条件下研究发酵条件。从培养基初始pH，培养温度及摇床转速3个方面做单因素实验。详细设计方案如表2所示。在发酵过程中每隔6 h取样测定植酸酶酶活力，确定最佳的发酵条件。

1.2.1.5 发酵培养

按配方配制发酵培养基，在250 mL三角瓶中装50 mL，115℃灭菌30 min，接种5 mL种子液。30℃，220 r/min摇床培养。每隔6 h取样，测总糖、酶活、pH和生物量。

表2 黑曲霉发酵条件优化单因素实验设计Table 2 Aspergillus Niger fermentation conditions optimization single factor experiment design

1.2.2 分析检测

1.2.2.1 植酸酶酶活力的测定

无机磷与钼酸铵结合，生成黄色的磷钼酸铵，再经过还原剂作用，则变为蓝色物质，在一定范围内蓝色的深浅与磷的含量成正比，可用比色法测定。利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，用VC-钼蓝法测定植酸酶活[7]。

酶活力单位的定义：在上述反应条件下，每毫升酶每分钟产生1毫微摩尔无机磷的酶量为一个植酸酶活力单位（U）。

1.2.2.2 发酵液总糖含量测定

总糖测定参见文献中蒽酮比色法测定食品中总糖含量[8]。

1.2.2.3 黑曲霉生物量及发酵液酸度测定

黑曲霉生物量采用干重法计量。发酵液酸度用实验室pH计测定。

2 结果与分析

2.1 磷标曲确定

根据实验设计测定磷含量，以光密度为纵坐标，磷含量为横坐标，制作磷标准曲线如图1。

图1 磷标准曲线Fig.1 Phosphorus standard curve

根据图1的标准曲线，通过测定发酵液的OD值，可以在曲线上对应磷含量，计算出植酸酶酶活力，然后分析发酵过程中酶活力的变化趋势。

2.2 总糖标曲确定

根据实验设计测定葡萄糖含量，以光密度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，制作葡萄糖标准曲线如图2。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Glucose standard curve

根据图2的标准曲线，通过测定发酵液的OD值，可以在曲线上对应葡萄糖含量。可以分析发酵过程中葡萄糖变化趋势。

2.3 发酵培养基优化

按照正交试验表进行发酵实验，在60 h时对摇瓶的植酸酶活进行测定，测定数据见表3。

表3 培养基优化实验结果与分析Table 3 Results and analysis of medium optimization experiment

由正交结果可以看出，实验12中发酵得到的植酸酶的活性最高。均值中，C源在因素3时获得最大，氮源在因素5获得最大，钾离子在因素4获得最大，亚铁离子在因素1获得最大，镁离子在因素5获得最大，锰离子在因素3获得最大。即最佳的配比为：5%可溶性淀粉，5%豆粕，0.9%KCl，0.1%FeSO4·7H2O，0.9%MgSO4·7H2O，0.5%MnSO4。根据极差可知，影响程度，MgSO4·7H2O＞可溶性淀粉＞豆粕＞MnSO4＞FeSO4·7H2O＞KCl。

2.4 发酵条件优化

2.4.1 最适初始pH确定

发酵培养基的pH对植酸酶酶活力有一定的影响。一般菌体的生长pH与产酶pH不一致，因此考虑对产酶pH进行优化，其余发酵参数参见培养基优化，结果见图3。

图3 不同初始pH对酶活的影响Fig.3 Effects of different initial pH value on enzyme activity

图3 显示在5个梯度的初始pH条件下，5条产酶曲线均在发酵培养60 h时表现出最高酶活，初始pH控制在5.5时，酶活力最高，达到18.51 U。

2.4.2 最适培养温度确定

温度是保证微生物生长和产物的合成的重要因素，也是保证酶活力的重要条件。温度太低或太高都不利于菌体生长和产酶，因此发酵是必须保证稳定而合适的温度环境[9]。其余发酵条件为：初始pH为5.5，摇床转速为300 r/min。由图4可以看出，黑曲霉发酵产植酸酶的最适发酵温度为30℃，植酸酶最高酶活力为19.02 U。温度低于或者高于30℃都不利于产酶，只是因为随着温度的变化，黑曲霉的生产代谢出现加快或者滞后的状态，没有达到最佳状态而提前衰老，从而影响酶的产量。

图4 不同发酵温度对酶活的影响Fig.4 Effects of different initial fermentation temperature on enzyme activity

2.4.3 最适摇床转速确定

摇床转速影响发酵过程中的溶氧，低溶氧条件对黑曲霉的生长不利，影响植酸酶的生成，转速对酶活力的影响如图5所示。

图5 不同摇床转速对酶活的影响Fig.5 Effects of different initial shaking speed on enzyme activity

随着转速的提高，黑曲霉生长比较好，植酸酶产量升高，在转速为220 r/min时达到最佳，酶活力达到了19.88 U。当超过220 r/min后，酶活力降低，表明高溶氧浓度不利于菌体的生长和酶的生成，原因可能是因为溶氧过高，发酵过程中的副产物增加，抑制了菌体的生长和酶的形成。

2.5 黑曲霉发酵产植酸酶

在优化的培养基与培养条件下，对黑曲霉的发酵过程进行监控，探索黑曲霉发酵产植酸酶过程中的总糖变化，pH变化，生物量变化以及植酸酶酶活力的变化过程。

图6 黑曲霉发酵产植酸酶实验Fig.6 Aspergillus Niger fermentation production phytase experiment

由图6可知，植酸酶酶活力在60 h达到了最大值19.927 8 U，最佳发酵时间为60 h。生物量的变化展现了黑曲霉的生产过程，在60 h之前成对数生长期，菌体生长较快，60 h～78 h是稳定期，78 h后进入衰退期。黑曲霉的生长状况与植酸酶的生产以及总糖的消耗情况相吻合。黑曲霉液态发酵产生的植酸酶属于酸性植酸酶，植酸酶酶学性质另文发表。

3 小结

黑曲霉液态发酵培养基优化得出最佳配比为：5%可溶性淀粉，5% 豆粕，0.9%KCl，0.1%FeSO4·7H2O，0.9%MgSO4·7H2O，0.5%MnSO4，影响程度，MgSO4·7H2O＞可溶性淀粉＞豆粕＞MnSO4＞FeSO4·7H2O＞KCl。发酵条件优化的最佳发酵时间为60 h，最适初始pH为5.5，最佳发酵温度为30℃，最佳摇床转速为220 r/min。

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