活性炭吸附罗非鱼下脚料蛋白酶解液及对风味成分的影响

李利敏，杨萍，张冠洲，洪鹏志

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

罗非鱼是淡水养殖业的重要养殖品种之一，也是联合国粮农组织推广养殖的种类之一[1]。目前全世界已有85个国家和地区养殖罗非鱼，年产量约200多万t。2006年我国罗非鱼产量超过100万t，占世界总产量的一半以上。广东具备养殖罗非鱼的得天独厚的优越条件，是我国养殖罗非鱼最早、养殖面积最多和产量最高的地区。在冷冻罗非鱼片的加工中，鱼片利用率只占整条鱼的40%左右，造成大量浪费，还容易对环境造成污染，而罗非鱼下脚料的主要成分是蛋白质，其蛋白酶解液有很高的营养价值，因此对罗非鱼加工下脚料的综合利用，可以降低罗非鱼的加工成本，提高罗非鱼的利用价值和经济价值。但是蛋白酶解液颜色较深、腥苦味较重，这给蛋白酶解液的应用带来了很大阻碍，如何解决这类问题，成为罗非鱼下脚料蛋白酶解液开发利用的关键问题。活性炭具有良好的吸附脱色特性，是食品工业中广泛使用的吸附澄清剂，已有关于活性炭对海洋蛋白酶解液脱腥脱色的研究[2-4]，但多以研究吸附工艺条件为主，少见有关于活性炭吸附对风味物质的影响的研究报道。本文用活性炭吸附处理罗非鱼下脚料蛋白酶解液，研究了吸附对脱色、蛋白质损失以及风味物质的影响，以期为罗非鱼下脚料蛋白酶解液的有效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼下脚料：湛江市恒兴水产科技有限公司提供，包括内脏、鱼头和鱼骨，去除内脏清洗干净，经绞肉机绞碎分装后，冻藏于实验室－18℃冷柜中备用。

活性炭（食品级Y-200）：长葛市通达活性炭厂；蛋白酶：木瓜蛋白酶：酶活力65×104U/g，中性蛋白酶：酶活力20×104U/g，广西南宁市庞博生物工程有限公司。

1.2 主要仪器设备

离心机；pH计；722S型紫外可见分光光度计；恒温水浴锅；GC-MS；同时蒸馏萃取装置等。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制备

罗非鱼下脚料自然解冻后，料液比 1∶2，pH7.0，于55℃的恒温水浴锅中，先加入中性蛋白酶水解1 h，后加入木瓜蛋白酶继续水解2 h（酶用量均为1 100 U/g原料），然后于90℃水浴灭酶10 min，冷却后，8 000 r/min离心15 min，去除上层油脂与下层残渣，中间层为酶解液。

1.3.2 吸附试验

酶解液中加入一定量的活性炭，在一定的pH、温度下吸附一段时间后，4 500 r/min离心20 min去除活性炭，进行脱色率、蛋白质损失率的测定。

1.3.3 脱色率测定

酶解液吸附前后在400 nm处的吸光度分别为OD400nm、OD′400nm，脱色率表示为 DE400nm。每个样品测定 3次取平均值。

脱色率DE400nm（%）=（吸附前OD400－吸附后OD400）/吸附前 OD400×100

1.3.4 蛋白质损失率测定

酶解液在210 nm～220 nm有最大吸收峰，主要是由肽健产生的。测定酶解液吸附前后的吸光度OD220nm、OD′220nm，蛋白质损失率表示为LP220nm。每个样品测定3次取平均值。

蛋白质损失率LP220nm（%）=（吸附前OD220－吸附后OD220）/吸附前 OD220×100

1.3.5 同时蒸馏萃取

取吸附前后的酶解液各100 mL，乙醚各60 mL，分别装在两个萃取瓶中，用电热套加热，乙醚温度为49℃，酶解液保持微沸状态，连接同时蒸馏萃取装置连续萃取2 h。收集乙醚萃取液，加入适量的无水硫酸钠，放入冰箱冷冻24 h后，过滤，浓缩至1 mL左右，贮于-18℃冰箱中，以备GC-MS分析。

1.3.6 GC-MS分析

气相色谱条件：色谱柱Rtx-5 ms石英毛细管柱30 m×0.25 μm×0.25 mm；升温程序：起始温度 50℃，保持2 min，然后以5℃/min的升温速度升温到300℃，再以10℃/min的升温速度升温到320℃；进样方式：手动（不分流）；进样口温度250℃；进样量1 μL；载气为 He；载气流量 1.58 mL/min；分流比 12∶1。

质谱条件：离子源EI源；电子能量70 eV；离子源温度为200℃；接口温度为250℃。

1.3.7 分析方法

定性分析：把按以上步骤获得的样品置入GC-MS联用仪进行分析鉴定，通过数据处理系统检索同时与NIST谱库 （107k compounds）和 Wiley谱库（320k Compounds，version 610）相匹配，仅列出匹配度大于80%的化合物，确认化合物成分。

定量分析：通过数据处理系统，按照面积归一化法进行定量分析，分别求得各化学成分的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 吸附适宜条件的确定

根据单因素预实验的结果（未列出），以pH、活性炭用量、温度、时间为变量，以脱色率和蛋白质损失率为指标，进行U9（96）均匀试验设计来优化吸附条件，选择出最佳优化方案，试验方案和结果见表1。

表1 U9（96）均匀试验方案及结果Table 1 Even test plan and results

对表1的试验结果进行全回归分析，获得关于蛋白质损失率（y1）、脱色率（y2）两个回归方程，蛋白质损失率（y1）方程在 α=0.20水平上呈显著，脱色率（y2）方程在α=0.15水平上呈显著。两个回归方程在一定程度上可以解释试验的结果。

本试验目的是要求脱色率越大越好，蛋白质损失率越小越好，因此对两个方程求其最大值或最小值时的最佳工艺条件，再综合单因素水平影响分析，结果见表2。

表2 吸附的最佳工艺条件Table 2 Optimum parameters of adsorption

从表2可以看出，不同的试验指标下最佳工艺条件是有所差异的，根据各工艺参数对结果的影响及综合各指标的重要程度，首先是损失率，其次为脱色率，因此选择吸附的工艺条件为pH6.0、活性炭用量0.85%、温度50℃和时间55 min。在此条件下的进行模型预测和验证试验，结果见表3。

表3 验证试验结果Table 3 The testing results

从表3可以看出，蛋白质损失率和脱色率的模型预测值与试验值时非常接近的，因此吸附的最佳工艺条件为pH6.0、活性炭用量0.85%、温度50℃和时间55 min；在此条件下损失率为6.6%，脱色率为49.2%，且吸附后的酶解液与吸附前样品相比，颜色呈淡黄色，色泽清澈，有轻微的鱼腥味，苦味不明显。

2.2 吸附对风味物质的影响

罗非鱼下脚料蛋白酶解液主要由氨基酸、小分子多肽和核苷酸等呈味物质组成，其腥臭味来源于原料本身和水解过程，其形成的主要原因有[5]：（1）养殖环境的影响。鱼饲料、水产动物食用的藻类、水质等条件对腥味物质的形成都有一定作用。Suffet等[6]研究了水体中对鱼腥味形成有作用的物质，认为主要有己醛（hexanal）、庚醛（heptanal）、反-2，顺-4-癸二烯醛（trans，cis-2，4-Decadienal）、反-2，顺-4，顺-7 癸三烯醛 （2-trans，4-cis，7-cis-decatrienal）、反-4-庚醛（trans，4-Hept-enal）及 1-戊烯-3 酮（1-penten-3-one）等物质。（2）在储藏和处理的过程中，由于一些物理和机械作用，鱼类体表会对体外的一些挥发性有机物化合物产生吸附，从而加重鱼类本身固有的腥味。（3）鱼类体中的物质发生生化反应，产生异味物质，如体内的脂肪酸自动氧化，会产生一些腥臭物质，一些多脂类鱼在冻藏过程中会伴随油烧的发生，使乙醛（ethanal）、丙醛（propanal）、丁醛（n-butylaldehyde）、戊醛（n-pentanal）等醛类显著增加[7]，很多学者认为脂质氧化是造成鱼类腥臭气味加重的重要因素；鱼表皮粘液和体内含有各种蛋白质，分解成肽和氨基酸后，在酶和微生物的作用下，进一步经过脱羧和脱氨反应生成有δ-氨基戊醛、δ-氨基戊酸和六羟基吡啶等腥味物质。

GC-MS分析活性炭吸附前后酶解液风味物质结果见图1、2 和表4、5。

图1 罗非鱼下脚料酶解液GC-MS总离子流图谱（吸附前）Fig.1 Ion chromatograph of Tilapia scraps enzymatic hydrolysate by GC-MS（before adsorption）

图2 罗非鱼下脚料酶解液GC-MS总离子流图谱（吸附后）Fig.2 Ion chromatograph of Tilapia scraps enzymatic hydrolysate by GC-MS（after adsorption）

从表4、5中可以看出，检测到的风味物质主要包括酯类、醛类、酮类、醇类、酸类、胺类和一些杂环类等，其中含量较多的有酯类、醛类和醇类。吸附前检测到的风味物质主要种类按照相对含量比例依次为醛类、酯类、醇类、酮类、胺类、酸类。相对含量较高的醛类、酯类、醇类分别达到33.27%、23.1%、9.51%；吸附后检测到的风味物质主要种类按照相对含量比例依次为酯类、醛类、酮类、醇类、酸类、胺类。相对含量较高的酯类、醛类、酮类分别达到26.19%、16.35%、6.95%。

通过表4、5对比可知，吸附前后，各类物质的相对含量均发生了变化。变化最为显著的为醛类，吸附前后由33.27%降到16.35%，此外醇类由9.51%降到6.05%，胺类由3.76%降到2.03%；而酯类、酮类、酸类的相对含量都有提高，其中酯类由23.10%升到26.19%，酮类由4.26%升到6.95%，酸类由0.50%升到3.30%，因此可知活性炭对醇类、醛类和胺类的吸附能力较强。

表4 吸附前主要风味物质及含量Table 4 The main flavor substances and content before adsorption

表5 吸附后主要风味物质及含量Table 5 The main flavor substances and content after adsorption

综合以上分析可知，罗非鱼下脚料酶解液经活性炭吸附后，影响腥味严重的醛类、酮类和胺类明显减小，此外一些研究证明腥味物质被吸附的同时一些苦味肽也被明显吸附[8]，所以经过活性炭吸附以后腥苦味降低。

3 结论

通过均匀实验设计对活性炭吸附罗非鱼下脚料蛋白酶解液的工艺条件进行优化，结果表明：在pH6.0、活性炭用量0.85%、温度50℃、时间55 min的条件下吸附，蛋白质损失率为6.6%，脱色率为49.2%；且吸附后的酶解液颜色呈淡黄色，色泽清澈，有轻微的鱼腥味，苦味不明显，影响腥味严重的醛类、酮类和胺类明显减小；由此吸附以后的酶解液外观澄清透明，腥苦味较弱，易于被人们接受，这为罗非鱼下脚料蛋白的有效利用提供了重要的理论依据。

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