玉米高F值寡肽的制备研究

金英姿，王大为

（1.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐830021；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

玉米是世界三大粮食作物之一，也是我国传统的农作物，2011/2012年我国玉米总产量为1.89亿t，其丰富的产量和可利用价值而受到广泛的关注，玉米资源深加工，其开发的产品种类很多[1-2]，生产的产品如淀粉、淀粉糖、有机酸、氨基酸等[3]。玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是以玉米为原料进行深加工企业的主要副产物，含蛋白质高达65%，氨基酸组成独特，其支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸等含量高，而芳香族氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸含量很低，是制备高F值寡肽的天然理想原料[4]。

玉米高F值寡肽是重要的植物蛋白肽，易于消化吸收，具有特殊的功能和生理活性，如纠正肝脏病人低支高芳病态血液模式，减轻或消除肝性脑病症状[5]；支链氨基酸具有改善负氮平衡作用，改善病人的蛋白质营养状况[6]；低聚肽能使机体耐力增加，对运动负荷适应能力提高[7]；富含亮氨酸等疏水性氨基酸的肽，可以降低血清胆固醇浓度[8]等，因此可被广泛用于医药和功能食品生产等领域，应用前景十分广阔。

目前我国年产玉米蛋白粉21万t，主要用于低值粗饲料生产，或自然排放，造成蛋白质资源浪费和环境污染[9]。开发玉米蛋白高F值寡肽等高附加值产品，则可大幅度提升玉米深加工企业的经济效益。本研究通过对玉米黄粉酶法水解，可以获得高F值寡肽产品，从而提高玉米蛋白粉的生物利用价值，促进玉米产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米蛋白粉，经处理蛋白质含量90%以上；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶：Sigama公司出品；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GB204 METTLER TOLEDO电子精密天平：梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司；HA 121-50-02型超临界CO2萃取装置：南通超临界萃取有限公司；ZD-2自动电位滴定仪：上海启威电子有限公司；pHS-3C型pH计：上海精密科学仪器有限公司；HH-601超级恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；JJ-1型数显电动搅拌器：常州蒙特仪器制造有限公司；KDN-04D/08D凯氏定氮仪：北京众益中和生物技术有限公司；pH-stat装置（自制）；J2-21型离心机：常州国华电器有限公司；WF-250型万能粉碎机：海蓝深制药机械有限公司；ZF-6050型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；754型紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；高压液相色谱仪：日本岛津公司；835-50型氨基酸自动分析仪：日本日立公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 酶活力测定

酶活力测定采用Folin－酚试剂法[10]。

1.3.2 水解物中氨基氮的测定

水解物中氨基态氮的测定用甲醛电位滴定法测定[11]。吸取含氨基酸约20 mg的样品溶液于100 mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20 mL置于200 mL烧杯中，加水60 mL，开动磁力搅拌器，用0.05 mol/L的NaOH标准溶液至酸度指示剂指示8.2。加入10 mL甲醛溶液，混匀。再用上述NaOH标准溶液继续滴定至pH 9.2，记录NaOH消耗标准溶液的体积（V1）。

同时取80 mL蒸馏水置于另一洁净烧杯中，先用NaOH标准溶液调至pH8.2（此时不计耗碱量），再加入10 mL甲醛溶液，用0.05 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH9.2，记录消耗NaOH标准溶液的体积（V2），作为试剂空白试验。

式中：V1为水解液在加入甲醛后滴定至终点（9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；V2为空白试验中加入甲醛后滴定至终点（9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；C为氢氧化钠标准溶液的浓度，（mol/L）；M为测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014 0为氮的毫摩尔质量，（g/mmol）。由于氨基氮的含量与耗碱量成正比，所以用耗碱量来间接反映氨基氮的含量大小。

1.3.3 水解度的测定

水解度的测定采用pH-stat法[12-13]。

1.3.4 工艺流程

玉米蛋白粉→控制酶解成酶解液→灭酶→离心分离→去芳香族氨基酸→脱盐→浓缩→干燥→高F值寡肽

1.3.5 试验操作过程

以碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉后的水解液（离心后的上清液）为底物，在一定的温度下保温10 min，用4 mol/L HCl调pH，加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解液加热至90℃，保温10 min进行灭酶，迅速冷却到室温，离心机4 000 r/min分离15 min，得上清液；用活性炭吸附芳香族氨基酸2 h，离心10 min（3 000 r/min）取上清液；将上清液脱盐（采用阴阳离子交换树脂），浓缩干燥即得玉米高F值寡肽[14-15]。

1.3.6 木瓜蛋白酶酶解条件的单因素试验设计

1.3.6.1 温度对耗碱量的影响

取碱性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，pH7.0、木瓜蛋白酶的酶添加量4 g/100 g、水解时间3.5 h，分别考察温度为40、45、50、55、60℃时耗碱量的变化情况。

1.3.6.2 时间对耗碱量的影响

取碱性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，pH 7.0、木瓜蛋白酶的酶添加量4 g/100 g、水解温度为55℃，分别考察时间为2.5、3.5、4.5 h时耗碱量的变化。

1.3.6.3 酶添加量对耗碱量的影响

取碱性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，pH7.0、温度为55℃、水解时间3.5 h，分别考察木瓜蛋白酶的酶添加量为2、3、4、5 g/100 g时耗碱量的变化。

1.3.6.4 pH对耗碱量的影响

取碱性蛋白酶酶解后的上清液50 mL，水解温度为55℃。木瓜蛋白酶的酶添加量4 g/100 g、水解时间3.5 h，分别考察pH为6.5、7.0、7.5时耗碱量的变化情况。

1.3.7 木瓜蛋白酶酶解条件的优化

依据单因素试验结果，采用正交试验，选择对影响玉米蛋白水解的4个因素：温度（A）、时间（B）、酶添加量（C）和pH（D），设计四因素三水平正交试验，以耗碱量为考察指标，对木瓜蛋白酶水解玉米蛋白的水解条件进行优化。见表1。

表1 木瓜蛋白酶L9（34）正交试验设计Table 1Designation of L9（34）orthogonal test on pepsin protease

1.3.8 F值的测定

采用氨基酸自动分析仪测定支链氨基酸（BCAA：Leu、Ile、Val）和芳香族氨基酸（AAA：Tyr、Phe）的含量，根据所得的数据按式（2）进行计算。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶水解的正交试验结果与分析

通过正交试验，确定了木瓜蛋白酶水解的最适温度、时间、酶添加量和pH，正交试验结果见表2。

表2 木瓜蛋白酶酶解正交试验结果及分析Table 2 Analysis of orthogonal test results of pepsin protease

通过极差分析，可知各因素对木瓜蛋白酶酶解影响的主次关系为A＞D＞C＞B，在4个因素中，温度对水解度的影响最大，时间的影响最小，最佳组合为A3B2C3D2，即水解条件为温度为55℃，时间3.5 h，酶添加量为4.0 g/100 g，pH7.0。而正交表中最佳试验号为6号，进行A3B2C3D2验证重复实验，得此条件下消耗NaOH溶液的量为2.72 mL。

2.2 玉米高F值寡肽的氨基酸组成

经高效液相色谱和氨基酸成份分析测定寡肽分子量在200 Da～1 000 Da之间，制得的高F值寡肽中氨基酸的种类及含量见表3。

表3 高F值寡肽混合物氨基酸的种类和含量Table 3 Components and content of amino acid in high fischer ratio oligo-peptide mg/100 mL

由表3可知，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸含量较高，而苯丙氨酸和酪氨酸含量较低。制得的高F值寡肽中BCAA的含量为391.25 mg/100 mL，AAA含量很低，BCAA与AAA的比值即F值大于20，产品符合高F值寡肽的要求。

3 结论

确定了木瓜蛋白酶的较佳水解条件即温度为55℃，时间3.5 h，酶添加量为4.0 g/100 g，pH7.0，在此条件下消耗的NaOH溶液的体积为2.72 mL。通过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解玉米蛋白粉制得的玉米高F值寡肽，分子量在200 Da～1 000 Da之间，F值大于20，符合产品质量要求。

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