阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块中VEGF干预作用的研究

·论著·

阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块中VEGF干预作用的研究

马 晔，关瑞锦，马建芳

目的 探讨阿托伐他汀对实验兔动脉粥样硬化模型血脂、血管内皮生长因子(VEGF)水平及动脉粥样斑块内VEGF蛋白水平的影响。方法 20只新西兰大白兔，随机分为对照组5只，高脂组15只；高脂组喂养4 w，用球囊损伤腹主动脉后，随机分为模型组、低剂量他汀组、高剂量他汀组，每组各5只，共饲养12 w。ELISA检测各组血清TG、TC、LDL-C、VEGF；12 w末检测动脉粥样斑块内VEGF蛋白定量及VEGF mRNA水平。结果 与对照组相比，模型组、他汀组6 w和12 w血清LDL-C、TG、TC和VEGF均显著增高(P<0.01)；与模型组比较，他汀组血脂和血清VEGF明显降低(P<0.05)；与低剂量他汀组比较，高剂量他汀组血脂和血清VEGF明显降低(P<0.05)；与模型组比较，他汀组动脉粥样硬化斑块中VEGF蛋白水平下调，但高剂量他汀组显著降低动脉粥样硬化斑块中VEGF的表达(P<0.05)。结论 兔动脉粥样硬化模型血清VEGF水平及动脉粥样硬化斑块内VEGF高表达，阿托伐他汀可下调AS斑块内VEGF的表达水平。

动脉粥样硬化；血管内皮生长因子；阿托伐他汀；兔

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种由多种炎症细胞和炎症介质参与的慢性疾病，炎症微环境对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达有显著影响，并与炎症细胞共同参与炎症过程[1-2]。新生血管是AS斑块发展进程中的重要伴随现象，VEGF作为新生血管形成的中枢调节因子，对其分化成熟及血管形成起着重要的调控作用。本研究通过动物实验观察AS斑块内VEGF的表达及阿托伐他汀对其干预作用的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性新西兰大白兔20只，2～3月龄，体重约1.3～2.1 k g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养许可证SYXK(军)2007-031。室温18～22 ℃，湿度(50±10)%。

1.2 主要仪器、试剂盒和药品 兔TC、TG、LDL-C和VEGF ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)；Biozol Reagent、RNase free ddH2O[BIOER(杭州)]；多聚赖氨酸Sigma；VEGF一抗(武汉基因美)；羊抗兔二抗(invitrogen)(中杉金桥)；BIOZOL总RNA提取试剂、BioRT cDNA 第一链合成试剂盒、BioEasy SYBR Green I 荧光PCR试剂盒(杭州博日)；HM315R切片机(德国)；PCR仪(ABi美国)；生物显微镜(Nikon Eclipse 55I,彩色数字CCD)；阿托伐他汀钙片(辉瑞公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组 20只新西兰雄性大白兔，随机分对照组5只(普通饲料，每只100 g/d)、高脂组15只(高脂饲料，每只100 g/d)。高脂组喂养4 w，用球囊损伤腹主动脉后随机分为模型组5只(高脂饲料)、高剂量他汀组5只[高脂饲料+阿托伐他汀10 mg/(kg·d)]；低剂量他汀组5只[高脂饲料+阿托伐他汀5 mg/(kg·d)]。药物干预组阿托伐他汀片水溶后灌胃，1次/d，模型组以等剂量生理盐水灌胃，饲养12 w。高脂饲料配方：普通饲料84%+10%蛋黄粉+1%胆固醇+5%猪油。

1.3.2 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C和VEGF测定 分别在0、6、12 w于兔耳缘静脉采血5 ml，采血前禁食12 h，离心后提取血清，用ELISA法检测血清TG、TC、LDL-C、VEGF水平。具体操作按说明书。

1.3.3 Western blotting检测VEGF蛋白含量 12 w后空气栓塞处死实验兔并剪取腹主动脉，提取组织蛋白质并制备SDS-PAGE 凝胶，样品变性后电泳，经凝胶转膜、一抗封闭、洗膜、二抗封闭再洗膜，美国UVP分析仪对胶片进行扫描，系统自动生成灰度值，即为结果。

1.3.4 荧光定量PCR检测VEGF mRNA的表达 血管组织抽提RNA后保存于-70 ℃；在Applied Biosystems 7500 Fast荧光定量PCR仪上进行PCR反应；PCR反应 92 ℃ 10 min，(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)40个循环，4 ℃保存。GAPDH作为内参基因，采用2-ddCt法对目的基因进行相对定量。引物信息：VEGF正向引物5′CGATCGAGACCTTGGTGGACAT 3′,反向引物5′TGCATGGTGACGTTGAACTCCT 3′；GAPDH正向引物5′ACCCATCACCATCTTCCAGGAG 3′,反向引物5′GAAGGGGCGGAGATGATGAC3′。

1.4 统计学方法 应用PEMS 3.1统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示。多组间均数比较采用t检验，组间两两比较采用SNK检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组兔不同时间点血脂和VEGF水平 分别于第0、6和12 w检测不同组兔血LDL-C、TG、TC和VEGF水平。与对照组相比，模型组、低剂量他汀组、高剂量他汀组在6和12 w的血LDL-C、TG、TC、VEGF均显著增高(P<0.01)；与模型组比较，他汀组血LDL-C、TG、TC、VEGF在第6 w和12 w有明显降低，但高剂量他汀组降低更为明显(P<0.05)。见表1。

2.2 各组兔动脉血管内膜病理学改变 HE染色后对照组动脉内皮完整，无脂质沉积。模型组内皮增生、增厚，管腔明显变窄，有大量泡沫细胞和脂质沉积，中膜变薄。他汀药物干预组血管内膜不同程度增厚和泡沫细胞形成。见图1。

2.3 各组兔AS斑块内VEGF蛋白表达 与对照组比较，模型组AS斑块中VEGF的表达显著增高(P<0.01)。与模型组比较，阿托伐他汀干预组均能降低VEGF在AS斑块中的表达，但高剂量阿托伐他汀组较低剂量阿托伐他汀组能进一步降低兔AS斑块中VEGF的表达(P<0.05，表2)。

2.4 各组兔AS斑块内VEGF mRNA的表达 与对照组比较，模型组及他汀组VEGF mRNA的表达水平更为显著(P<0.01)。与模型组比较，他汀药物组能降低兔AS斑块VEGF mRNA的表达水平(P<0.05)。与低剂量阿托伐他汀组比较，高剂量组能降低VEGF mRNA的表达(P<0.05)。

表1 不同时间点各组兔血脂及VEGF水平(n=5)

注： 与同时间对照组比较，①P<0.01；与同时间模型组比较，②P<0.05；与同时间低剂量阿托伐他汀组比较，③P<0.05；与本组0 w比较，④P<0.01；与本组6 w比较，⑤P<0.05

对照组

模型组

低剂量阿托伐他汀组

高剂量阿托伐他汀组

组别VEGF/β⁃actinVEGFmRNA/GAPDH对照组0．24±0．000．95±0．07模型组0．78±0．02①2．80±0．24①低剂量他汀组0．55±0．02①②1．91±0．26①②高剂量他汀组0．42±0．03①②1．44±0．02①②③

注：与对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05； 与低剂量阿托伐他汀组比较，③P<0.05

3 讨论

血脂异常是AS发生发展的重要因素，本研究表明，高脂饲料喂养联合球囊损伤组兔在第6 w和12 w时血清TG、LDL-C、TC水平逐渐显著增高。其腹主动脉HE染色可见典型的AS改变，此结果与国内相关研究结果一致[3]。

本研究采用高脂饲料喂养联合球囊损伤血管内皮致血管通透性的增加，进一步导致大量脂质沉积血管内膜下，触发LDL成OX-LDL。同时在多种炎性因子的共同作用下，促进AS斑块中VEGF的表达上调[4]。VEGF是一种与血管增殖密切相关的多肽生长因子，是最直接的血管内皮细胞促分裂素。血管内皮细胞是VEGF发挥作用的主要靶器官，研究表明其在体内外均具有促进内皮细胞增殖、迁移、出牙及血管腔形成等功能[5]。同时，VEGF作为血管生成旁分泌刺激因子，其表达受多种途径信号通路的调节，细胞因子等对VEGF的表达也起调控作用，而且，外源性VEGF可促进AS斑块形成[6]。

本研究显示，10 mg/(kg·d)和5 mg/(kg·d)阿托伐他汀组较模型组血清TG、LDL-C、TG水平显著降低，动脉粥样硬化病变程度较轻。同时10 mg/(kg·d)能更有效降低AS斑块内VEGF mRNA水平。多项研究表明，负荷剂量的阿托伐他汀在降脂、稳定粥样斑块、抗炎方面优于常规剂量，能明显减少心血管事件，并具有剂量依赖关系[7-9]。阿托伐他汀通过优化血管内皮，降低VEGF及相关蛋白的表达，延缓甚至逆转AS的进展。因此，阿托伐他汀可以减少斑块内血管生成，达到稳定斑块的作用[10]。ARMYDA-ACS研究，正是基于充分应用他汀类药物的调脂外作用的基本理论并获得明显效果。

阿托伐他汀在发挥降脂作用之外，还可降低兔AS模型血清VEGF水平，抑制AS斑块内VEGF mRNA的表达。因此，可以推测阿托伐他汀通过下调动脉粥样斑块内VEGF的表达，从而抑制新生血管形成途径达到稳定AS斑块的作用。

[1] Akeson A,Herman a,Winginton D,et al.Endothelial cell activation in a VEGF-A gadient:relevance to cell fate decisions[J].Microvascular Research,2010,80(1):65-74.

[2] Libby P,Ridker PM,Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347):317-325.

[3] 王园园,尤民惠,周磊磊,等.兔动脉动脉粥样硬化模型的建立和评价[J].实验动物学,2008,25(3):18-20.

[4] Neuhaus T,Lutz C,Stier S,et al.The use of suppression subtractive hybridization for the study of SDF-1a induced gene expression in human endothelial cells[J].Mol Cell Probes,2003,17(39):245-252.

[5] 蒋雷,陈燕凌,余菲菲,等.胆囊癌组织中血管内皮生长因子C和D的表达及其与淋巴管和血管生成的关系 [J].中华肿瘤杂志,2010,32(3):190-195.

[6] 肖敏,王玮,党书毅,等.血管内皮生长因子165对实验性兔动脉粥样硬化斑块形成的影响[J].中国动脉硬化杂志,2000,8(2):11-18.

[7] 李建勇,胡大一,史旭波,等,不同剂量阿托伐他汀对冠心病患者的疗效和安全性多中心研究[J].中华心血管病杂志,2005,33(12):1085-1087.

[8] 刘广安,刘峰,陈润祥,等.负荷剂量阿托伐他汀降低冠状动脉介入围手术期心血管事件作用和机制的探讨[J].实用临床医药杂志,2011,15(9):22-28.

[9] 张晓娟,李保,王敬萍,等.不同剂量阿托伐他汀对冠脉介入治疗吸纳后炎症因子的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(7):791-792.

[10] 张燕,夏豪,聂小磊.阿托伐他汀对大鼠动脉粥样硬化不稳定斑块内新生血管的影响[J].心脏杂志,2010,22(5):654-657.

Effects of atorvastatin on VEGF in atherosclerotic plaque in rabbits

Ma Ye1,Guan Ruijin2,Ma Jianfang1

1.Department of Geriatrics,Hospital 476 of Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command,Fuzhou,Fujiang,350002,China;2.Department of Cardiology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou,Fujiang,350002,China

Objective To study the effects of atorvastatin on serum lipid and vascular endothelial growth factor(VEGF)and its effects on VEGF in atherosclerotic plaque in rabbit model.Methods 20 New Zealand rabbits were randomly divided into 2 groups:control group(n=5)and hyper-cholesterol group(n=15).The rabbits in hyper-cholesterol group were fed with hyper-cholesterol diet for 4 weeks and then catheter-induced abdominal aorta injury was made to them;then the 15 rabbits were randomly subdivided into 3 groups:model group(n=5)；low-dose atorvastatin group(n=5)and high-dose atorvastatin group(n=5).All rabbits were kept feeding for 12 weeks.The enzyme-linked immunosorbent assay was applied to measure the serum TC,TG,LDL-C and VEGF of animals at the end of the 12th week;VEGF protein and mRNA in atherosclerotic plaque were detected.Results The serum LDL-C,TG,TC and VEGF in model group and atorvastatin groups at the 6th and 12th week were higher than those in control group(P<0.01);the serum lipid and VEGF in high-dose atorvastatin group decreased more than those in low-dose group(P<0.05);the level of VEGF protein in atherosclerotic plaque of the rabbits in atorvasatin groups dropped down more than that of the rabbits in model group and the decrease in high-dose group was more obvious(P<0.05).Conclusions The expression level of VEGF is high in serum and atherosclerotic plaque of rabbit' model and atorvastatin can down-regulate the expression level of VEGF in atherosclerotic plaque.

atherosclerosis;vascular endothelial growth factor(VEGF);atorvastatin;rabbit

南京军区面上项目(12MB027)

350002 福州，南京军区福州总院476医院老年科(马 晔，马建芳)；福建省立医院心内科(关瑞锦)

R 543.5

A

1004-0188(2014)05-0465-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.05.001

2013-05-20)