CYP2C9-1061A/C基因多态性对特发性房颤患者华法林用量的影响

CYP2C9-1061A/C基因多态性对特发性房颤患者华法林用量的影响

李 锐，邱 健 ，马 骏，黎建安，何建新，阮云军，肖 华，张 园，叶丽丽

目的 探讨CYP2C9-1601A/C基因多态性在广东地区特发性房颤患者中的分布及其对华法林用量的影响。方法 选择广东地区特发性房颤患者150例为病例组，正常人群120 例作为对照组，采用PCR-RFLP方法检测CYP2C9基因，比较两组CYP2C9-1601A/C基因型分布特征，并对不同基因型的特发性房颤患者华法林用量进行对比分析。结果 CYP2C9基因1601位A碱基突变为C后，能够被Kpn Ⅰ内切酶识别，产生134 bp和18 bp两个片段。特发性房颤患者中，CYP2C9-1061 AA型105例(70.0%)，AC型40例(26.7%)，CC型5例(3.3%)。AC型比例显著高于正常人群(χ2=13.3259，P=0.0003)，AA型比例显著低于正常人群(χ2=14.5200，P=0.0000)，CC型发生率两组无显著差异(χ2=0.2218，P=0.6377)。AC型及CC型患者华法林用量(3.62±0.58)mg、(3.12±0.16)mg均显著低于AA型的(4.28±0.63)mg(P<0.01)；CC型患者低于AC型(P<0.05)。结论 广东地区特发性房颤患者中存在较多的CYP2C9 1061A/C基因多态性，并且CYP2C9 1061A/C突变使患者的华法林用量减低，可作为临床个体化用药的参考。

特发性房颤；CYP2C9；基因多态性；华法林

房颤是临床常见的心律失常，其中无明确病因及器质性心脏病的房颤称为特发性房颤。栓塞性脑卒中及其他血栓栓塞事件是房颤最严重的并发症之一，特别是脑卒中的发生率逐年增加，有较高的致死致残率[1]。华法林可以显著减少房颤血栓栓塞性事件，是目前预防房颤血栓栓塞事件的有效药物[2]。随着华法林药理作用分子机制的阐明和药物基因组学的进展，人们越来越重视部分相关基因的多态性作为遗传因素在华法林治疗剂量个体差异中的作用。细胞色素酶P450 2C9(cytochrome P450 family 2 subfamily C polypeptide 9,CYP2C9)基因是影响华法林治疗剂量个体差异的相关基因之一，它的基因多态性是影响华法林治疗剂量个体差异最主要的遗传因素[3-4]。本研究通过检测150例广东地区特发性房颤患者CYP2C9 1061A/C基因多态性，并与正常人对照，观察CYP2C9 1061A/C基因多态性在特发性房颤患者中的分布特征。并分别比较CYP2C9不同基因型组华法林日平均维持剂量，了解CYP2C9 1061A/C基因多态性对广东地区特发性房颤患者华法林日平均维持剂量的影响，为临床华法林抗凝治疗个体化给药提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组 选择广州军区广州总医院心血管内科确诊为特发性房颤的广东地区150例患者为病例组，其中男性96例，女性54例，年龄38～82岁，平均65.3岁。特发性房颤诊断标准采用《实用内科学》第13版制定的标准，所选患者均在本院全程治疗，有详细的临床检验和治疗资料。入选标准：能严格按照医嘱服药；使用同一厂家生产的华法林抗凝治疗后国际标准化比值(INR)稳定在2.0～3.0；年龄>18岁；汉族；确诊特发性房颤。排除标准：既往和现在有肝脏疾患、肝功能异常、肾功能不全、甲状腺功能异常；正在服用影响华法林代谢的药物；正在服用影响INR值的药物，基础INR值>1.4；不适合华法林治疗者。同时收集同期在我院门诊体检且性别、年龄等均与病例组匹配的正常人120 例作为对照组，常规化验无异常，无各类心血管、脑血管、肾脏、内分泌等方面疾病，其中男性82例，女性38例，年龄38～82岁，平均64.8岁。所有研究对象均测量身高、体重，并计算体表面积[BSA(m2)=0.0061×身高(cm)+0.0128×体重(kg)-0.01529]。

1.2 血标本采集 研究对象签署知情同意书后，抽取5 ml静脉血置于EDTA-Na2抗凝管中保存于-70 ℃低温冰箱中以备提取DNA。

1.3 观察指标

1.3.1 华法林剂量和INR 检测静脉血标本INR。记录病例组患者所服用的华法林维持剂量，即患者达到抗凝稳态(INR=2.0～3.0)时华法林日用量。

1.3.2 CYP2C9 1061A/C基因多态性 应用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态分析(PCR-RFLP)的方法检测基因多态性。采用上海生工生物技术服务公司提供的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，设计CYP2C9所需PCR的目的基因片段的引物(上游引物：5'-TGCACGTCCAGACCTAC-3'；下游引物：5'-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3') ，目的基因片段长度由上海生工生物技术服务公司合成。然后进行PCR扩增，扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计42个循环后72 ℃延伸5 min。将 CYP2C9的PCR 产物用Kpn Ⅰ内切酶(上海生工生物技术服务公司)进行酶切，37 ℃水浴 15～16 h。酶切产物采用具有高分辨能力的 3%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段进行DNA测序。

2 结果

2.1 CYP2C9基因1061A/C多态性 1061位A碱基突变为C后，多肽链第359位氨基酸Ile被Leu取代，突变的碱基C能够被Kpn Ⅰ内切酶识别，产生134 bp和18 bp两个片段，而野生型(AA型)不含Kpn Ⅰ酶切位点，电泳后仅显示1个152 bp片段；纯合变异型(CC型)产生134 bp和18 bp两个片段；杂合变异性(AC型)产生152 bp、134 bp和18 bp 3个片段。但由于18 bp片段分子量太小，在凝胶电泳上不易分辨，因此只能显示134 bp和152 bp片段(图1)。

图1 CYP2C9基因1061A/C多态性

2.2 CYP2C9基因1061A/C多态性在特发性房颤患者中的分布 150例特发性房颤患者中，CYP2C9-1061 AA型105例(70.0%)，AC型40例(26.7%)，CC型5例(3.3%)。 120例正常人群中，CYP2C9-1061 AA型107例(89.2%)，AC型11例(9.2%)，CC型2例(1.7%)。经检验两组人群中基因型分布频率观测值及预计值差异不显著，符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，表明样本均来自一个较大的并且处于随机婚配的平衡状态群体，具有代表性。特发性房颤患者中AC型比例显著高于正常人群(χ2=13.3259，P=0.0003)；AA型比例显著低于正常人群(χ2=14.5200，P=0.0000)，CC型发生率两组无显著差异(χ2=0.2218，P=0.6377)。

2.3 CYP2C9-1061A/C基因多态性对特发性房颤患者华法林用量的影响 不同基因型的特发性房颤患者年龄、男女比例及体表面积相比均无显著差异(P>0.05)。对比分析不同基因型患者达到抗凝稳态(INR=2.0～3.0)时华法林日用量，结果发现，不同基因型患者华法林用量不同，AA型用量最高，其次是AC型，最低是CC型(P<0.05或P<0.01，表1)。表明CYP2C9基因1061位A突变为C后，华法林用量减少。

表1 不同CYP2C9-1061基因型特发性房颤患者一般情况及华法林用量

注：与AA型相比，①P<0.01；与AC型相比，②P<0.05

3 讨论

华法林在人肝脏中主要由CYP2C9介导其羟化代谢，并且呈立体选择性，其中抗凝活性较强的S-华法林85%以上经由CYP2C9代谢转化为无活性的6-和7-羟化产物。因此，CYP2C9酶是影响华法林代谢的主要酶，其活性影响华法林的抗凝效果，机体CYP2C9酶活性越低，则单位剂量华法林的抗凝效果越强，机体所需华法林剂量越低。CYP2C9酶是由CYP2C9基因编码的。研究表明，CYP2C9在不同人群中的基因多态性与华法林的用量相关[5-7]。

Sanderson等[8]的系统评价显示，携带*2和/或*3突变的患者其华法林剂量较野生型患者低37%，但该研究并未纳入中国人群的相关研究。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率在不同民族中有较大差异。在中国人群中，没有发现CYP2C9*2突变，即没有发现CYP2C9 416C/T多态性，而存在较低的CYP2C9 1061A/C多态性，CYP2C9*3等位基因(C等位基因)频率约为3.3 %[9]。本研究结果显示，CYP2C9 1061A/C多态性在特发性房颤患者中发生率高于正常人群，并且主要集中在AC型。

CYP2C9基因具有高度遗传多态性，较常见的基因突变体是位于外显子3的CYP2C9*2(416C/T) 和位于外显子7的CYP2C9*3(1061A/C)，二者已被证明与个体需要较低剂量的华法林有关，因其编码的CYP2C9酶活性显著降低[10]。携带这两个等位基因的个体达到稳态浓度所需要的华法林治疗剂量较低，且在使用初期有较高出血危险性。 关于CYP2C9 基因多态性与华法林剂量关系，目前国外研究一致认为：它的两种突变型 CYP2C9*2(外显子3的416位碱基C突变为 T，导致多肽链第 144位氨基酸Arg被Cys取代)和 CYP2C9*3(外显子7的第1061位碱基A突变为 C，导致多肽链第 359 位氨基酸Ile被Leu取代)都导致CYP2C9酶活性降低，从而导致个体抗凝所需的华法林剂量降低。本研究发现，碱基A突变为C后，华法林的用量显著降低。

综上所述，广东地区特发性房颤患者中存在较多的CYP2C9 1061A/C基因多态性，并且不同CYP2C9 1061A/C基因型患者华法林用量不同，其中突变型显著低于野生型。可见CYP2C9 1061A/C基因多态性对特发性房颤患者华法林用量具有指导价值，可作为临床个体化用药的参考依据。

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Effects of CYP2C9-1061A/C gene polymorphism on dosage of warfarin for patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation

Li Rui1,Qiu Jian1,Ma Jun1,Li Jianan2,He Jianxin1,Ruan Yunjun1,Xiao Hua1,Zhang Yuan1,Ye Lili1

1.Department of Cardiology,General Hospital of Guanzhou Military Command,Guangzhou,Guangdong,510010,China;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children's Hospital and Health Institute,Guangzhou,Guangdong,510010,China

Objective To explore the distribution of CYP2C9-1061A/C gene polymorphism in patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation in Guangdong area and its effects on the dosage of warfarin.Methods 150 patients with idiopathic atrial paroxysmal fibrillation from Guangdong area were considered as patient group,and 120 healthy people from the same area were regarded as control group.The difference of the distribution of CYP2C9-1061A/C gene polymorphism detected by PCR-RFLP between the 2 groups was compared and the difference of dosage of warfarin for the patients with different genotype was analyzed each other.Results The CYP2C9 gene fragment was cut into 134 bp and 18 bp by Kpn Ⅰ enzyme after the A base was mutated by C base.There were 105 patients (70.0%) with AA type,40 ones (26.7%) with AC type and 5 ones (3.3%) with CC type.Compared with the normal people,the ratio of AC type in patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation was higher(χ2=13.3259，P=0.0003),AA ratio was lower(χ2=14.5200，P=0.0000),but CC ratio was not different obviously(χ2=0.2218，P=0.6377).The dosage of warfarin for patients with AC and CC type [(3.62±0.58)mg,(3.12±0.16)mg] was lower than that with AA type[(4.28±0.63)mg](P<0.01),and the dosage of warfarin for patients with CC type was lower than that with AC type(P<0.05).Conclusions There are more CYP2C9-1061A/C gene polymorphism in patients with idiopathic paroxysmal atrial fibrillation in Guangdong area.The mutation of CYP2C9-1061A/C decreases the dosage of warfarin.Therefore,CYP2C9 gene polymorphism can be used as reference to the personalized dosage regimen of warfarin in patients with idiopathic atrial paroxysmal fibrillation.

idiopathic paroxysmal atrial fibrillation；CYP2CP；gene polymorphism；warfarin

广东省医学科学技术研究基金(WSTJJ20111108广文字第036092号)

510010 广州，广州军区广州总医院心血管内科(李 锐，邱 健 ，马 骏，何建新，阮云军，肖 华，张 园，叶丽丽)；广东省妇幼保健院检验科(黎建安)

邱 健，E-mail:lirui109xn@163.com

R 541.75

A

1004-0188(2014)05-0476-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.05.005

2014-03-30)