硫化氢拮抗同型半胱氨酸刺激血小板聚集作用

崔玉英，王颖，王桂芳，张玉华，问慧娟

（1.河北大学 基础医学院，河北 保定 071000；2.安国市医院 脑外科，河北 安国 071200；3.河北大学 医学学科建设领导小组办公室，河北 保定 071000）

硫化氢（H2S）和同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）均为体内蛋氨酸代谢产物，蛋氨酸转移甲基后由S－腺苷HCY 脱腺苷生成HCY，HCY 通过转硫途径代谢生成H2S［1－3］，即HCY 在维生素B6依赖的胱硫醚－β－合成酶和胱硫醚－γ－裂解酶作用下被代谢为半胱氨酸、NH4＋及α－酮丁酸.半胱氨酸进一步分解形成H2S，α－酮丁酸以及牛磺酸［3－4］.任何原因导致的代谢酶缺陷（如维生素B6、B12和叶酸缺乏等）均可造成HCY 在体内蓄积，造成高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，HHCY），导致内皮功能损害及血小板过度活化，引发动静脉血栓形成和血管功能紊乱，是冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的独立危险因子［4－5］.

H2S作为HCY 的代谢产物，是继NO 后又一新的气体信号分子，具有舒张血管平滑肌、抑制心肌收缩力和血管平滑肌增殖、抑制血小板聚集等多种心血管生物学效应［6－8］，是调节循环稳态的重要的组织局部因子，在心肌缺血、血管钙化等多种心血管疾病发病中都具有重要的病理生理意义［8－10］.近年来研究发现H2S能减低HHCY 血症大鼠血浆HCY 的水平［6］，提示蛋氨酸代谢产物HCY 和H2S在生物学效应方面可能存在相互关系，但H2S对HHCY 血小板聚集功能的影响及机制尚不清楚.

本工作在高浓度HCY 与血小板离体孵育的模型上，采用不同浓度的H2S生理盐水溶液干预，观察血小板聚集功能和NO 释放的改变，以探讨H2S在HHCY 诱导血栓形成等心血管疾病发病中的可能作用.

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD 大鼠，体重230～250g，购自河北医科大学实验动物中心；按照河北大学动物管理条例和中华人民共和国卫生部医学实验动物管理实施细则执行.左旋精氨酸（L－Arg）、LD－同型半胱氨酸（LD－HCY）、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、对氨基苯磺胺和N－（1－萘基）－乙二胺均购自Sigma公司.H2S饱和气体生理盐水溶液由北京大学医学部心血管研究室提供.

1.2 血小板制备和实验分组［1，10－11］

大鼠禁食12h后采用戊巴比妥钠（40mg／kg腹腔注射）麻醉，腹主动脉取血，按9:1的体积比用3.8g／L的枸橼酸钠抗凝并混匀，参考文献［1，10－11］的方法制备富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP），调整血小板数为200×109／L用于血小板聚集实验.

另取部分PRP按体积比1:10悬浮于不含Ca2＋但含EGTA 0.1mmol／L的Hepes缓冲液中（mmol／L：NaCl 137，MgCl21.0，KCl 2.7，NaH2PO43.0 和Hepes 3.5，pH 7.4），在4 ℃条件下1 500×g 离心10min后，弃上清液并重复洗脱1次.血小板重悬于Hepes缓冲液中（含葡萄糖10mmol／L），调整血小板数为1×108／mL.每管血小板混悬液1mL，分别加入下述药物：1）对照组，加入等体积生理盐水.2）HCY 组，加入HCY 100μmol／L.3）H2S组，加入H2S生理盐水溶液50μmol／L.4）HCY＋H2S低、中、高和极高剂量组，均加入HCY 100μmol／L基础上，同时分别加入H2S生理盐水溶液10，50，100，1000μmol／L.各组在37 ℃恒温水浴（O2与CO2体积比95:5）中震荡孵育2h，结束孵育后4 ℃离心（1 500×g 离心5min），取孵育液待测亚硝酸盐含量.

1.3 血小板聚集功能测定［4，7］

采用上海通用医用仪器公司TYXN－91多功能智能血液聚集仪.参照文献［4，7］，分别取300μL PPP和PRP（含血小板200×109／L）放于血小板聚集测定管中，按上述各实验分组加药，于37 ℃恒温水浴（O2与CO2体积比95:5）中震荡孵育30min后，置于预热孔并加入ADP 10μmol／L（致聚剂），以PPP组作为空白对照管，采用比浊法在血小板聚集仪上测定10min，分别测定2，4min时血小板聚集率和最大血小板聚集率（platelet aggregation，PAP）.

1.4 血小板NO 生成功能测定［10－11］

以血小板孵育液中亚硝酸盐（NO2－）含量反映血小板NO 的生成.参照文献［10－11］的方法，取血小板孵育液0.1mL，加入Greiss试剂0.1mL（20g／L对氨基苯磺胺和2g／L N－（1－萘基）－乙二胺按体积比1:1，临用前混匀），10min 后，采用酶标仪在550nm 波长下测定其吸光度值.以NaNO2作为空白对照管作标准曲线，计算各组样品中每108血小板产生的亚硝酸盐含量.

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 H2S拮抗HCY促血小板聚集作用

实验各组在37 ℃恒温水浴箱中预孵育10min后，加入ADP 10μmol／L 后检测10min，分别测定2，4min和最大的血小板聚集率.对照组血小板最大聚集率为（70.01±5.35）%.与对照组比，HCY 组可使ADP诱导的血小板最大聚集率增加16%；H2S 组则使其减少21%（均P＜0.01），与文献报道相符［2，4］.但H2S（10，50，100，1 000μmol／L）和HCY 共孵育，呈浓度依赖的抑制ADP 诱导的血小板聚集，分别较单纯HCY 组减少7%，15%，43%和38% （均P＜0.01），以H2S 100μmol／L 的 作 用 达 峰 值，H2S 100 和1 000μmol／L 2组的作用无显著差异（P＞0.05）（表1）.

表1 H2S对HCY 刺激ADP诱导大鼠血小板聚集作用的影响Tab.1 Effects of H2S on HCY activated rats platelet aggregation which induced by ADP（10μmol／L）

2.2 H2S拮抗HCY抑制血小板NO 生成作用

血小板离体孵育2h 后，对照组每108血小板孵育液中NO2－含量为（3.63±0.05）nmol；HCY 组和H2S组较对照组分别减少50%和42%（均P＜0.01）；而H2S（10～1 000μmol／L）与HCY 100μmol／L共孵育，血小板孵育液中NO2－含量较HCY 组分别增加1.58（P＜0.05），2.05，1.77（P＜0.01）和1.52倍（P＜0.05）.Person相关分析，H2S拮抗HCY 促血小板聚集作用与血小板孵育液NO2－含量的改变呈显著负相关，r2＝－0.438 7，P＜0.01.95%可信区间（confidence interval，95%CI）为－0.757 4～－0.278 2（图1）.

图1 H2S对HCY减少大鼠血小板NO 生成的影响Fig.1 Effects of H2S on the homocysteine decreased NO production in rat platelets

3 讨论

血小板黏附聚集是动脉粥样硬化发生发展和血栓形成的重要环节［1，11］，NO 是调节血小板活化的重要气体信号分子，是由血液中L－精氨酸经过细胞膜上阳离子氨基酸转运体转运入细胞内并在NO 合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化下产生，具有清除氧自由基、舒张血管平滑肌、抑制血小板黏附聚集及阻止动静脉血栓形成的作用，对维持心血管功能稳态和血小板自身稳态具有重要作用［10－12］.HCY 在体内极易氧化，产生大量氧自由基，对细胞广泛损伤，干扰血小板NO 生成，促进血小板活化和凝血，刺激血管平滑肌细胞增殖、损害内皮功能等［1－3］，是冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的独立危险因素［3－5］.

HCY 的代谢产物H2S，是调节血小板活化的又一种新的气体信号分子，通过开放KATP通道抑制血小板黏附聚集［6－7］.近年来研究发现，H2S对心血管系统具有广泛的保护作用，H2S能清除氧自由基，外源性补充H2S可减轻心脏缺血再灌注损伤，抑制血管钙化，减轻颈动脉球囊拉伤大鼠内膜的损害［12－14］.由于H2S和HCY 均为蛋氨酸代谢产物，共处于体内同一代谢通路中胱硫醚－γ－裂解酶的上、下游，其生物学效应的相互作用应高度重视，但H2S对HHCY 时血小板聚集功能、NO 的影响及H2S和HCY 间的关系尚不清楚.

本实验显示HCY 促进血小板聚集，H2S 显著抑制血小板聚集，与文献报道相符［3－5］.而不同浓度的H2S与HCY 共孵育，可拮抗HCY 刺激血小板聚集的效应，其机制是否与NO 有关尚不清楚.进一步实验显示HCY 和H2S单独应用均抑制血小板NO 释放，与前期报道相符［1，9］；而H2S与HCY 共孵育，血小板NO生成较单独H2S组、HCY 组增多，NO 生成与血小板最大聚集率的改变呈显著负相关.提示H2S 降低HHCY 血小板聚集率与改善NO 生成有关；在HHCY 时血小板聚集功能增强，而H2S本身具有抑制血小板聚集作用，又通过增加NO 生成，加强抑制血小板聚集作用，对维持血小板功能稳态、防止血栓形成和动脉粥样硬化的发生发展具有重要意义.

H2S改善HHCY 血小板功能的机制，除了与改善NO 生成有关外，也可能与H2S能清除自由基、抑制脂质过氧化反应［7－8］、保护线粒体功能、维持细胞膜稳定和细胞内钙稳态等保护机制有关［8－14］.实验中H2S极高剂量组对血小板最大聚集率和NO 作用弱于高剂量组，是H2S自身抑制作用占优势还是剂量过大对血小板的损伤有待进一步探查.

机体通过释放多种生物活性物质以维持自身稳态，各活性物质间处于动态平衡的关系［2，5］.如蛋氨酸代谢的中间产物HCY 减少血小板NO 生成，促进血小板聚集［1］；而终末产物H2S可抑制血小板聚集功能和NO 生成［10］；NO 又能抑制血小板聚集，促进培养的血管平滑肌H2S 释放［12］；而本工作显示H2S 可改善HHCY 时血小板聚集功能和NO 生成，通过增加NO 生成，协同抑制血小板聚集以保持血小板功能稳态.提示蛋氨酸代谢产物HCY，H2S之间和气体信号分子H2S，NO 间均各自具有相对独立的生物学效应，但彼此间又相互作用形成复杂的“网络”关系和动态平衡.这种动态平衡失调，参与高血压、HHCY 和动脉粥样硬化的病理生理过程［5，10］，因此，调整蛋氨酸－HCY－H2S代谢通路、增加内源性保护物质是防治HHCY 和动脉粥样硬化的新思路，H2S作为HCY 生物学效应的机体内源性拮抗剂在HHCY 和血栓性疾病防治中具有广阔的应用前景.

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