化合物MDPE的抗肿瘤活性

李海晶，杨春柳，张晓旭，路惬楠，杨更亮

（河北大学 药学院，河北省药物质量分析控制重点实验室，河北 保定 071002）

肿瘤是由组织的细胞或变异细胞克隆性异常增殖而形成的，临床上将肿瘤分为良性和恶性两大类，其中恶性肿瘤又被称为癌症.癌症是一类严重威胁人类健康和生命的疾病［1］，随着人类生存环境的不断恶化，癌症的发病率出现逐年增高的趋势.据世界卫生组织（WHO）估计，到2030年，癌症的发病率将达1 320万人［2］.目前，化疗仍是治疗恶性肿瘤的主要手段，其中化疗药物的作用机制一般包括4种：干扰核酸的合成代谢，直接与DNA作用干扰其复制、抑制细胞有丝分裂、抑制蛋白质的合成，虽然化疗药物对肿瘤有一定的抑制作用，但副作用也很大，如白细胞增殖、骨髓抑制、恶心、呕吐等，严重影响到病人的生存质量.因此，开发研究能够提高疗效、减轻毒副作用的抗肿瘤药物已成为一个新的发展趋势［3］.

硫色满酮类化合物是一类高脂溶性、低水溶性且含有硫原子的杂环化合物.目前对硫色满酮类化合物的研究已经成为一个热点.Mark［4］指出，大多数3位取代硫色满酮类化合物的生物活性更高.方林等人［5］合成的3－取代硫色满酮衍生物和Biswanath等人［6］合成的3－苄基－硫色满酮化合物，均具有不同程度的抗菌活性.刘玉欣等人［7－8］研究了（顺）－3－（氯代亚甲基）－6－甲基－硫色酮－4－酮的体外抗肿瘤活性，能够明显抑制肿瘤细胞的生长，抗肿瘤活性优于顺铂.同时还研究了另外2种3位取代的硫色满酮类化合物的体外抗肿瘤活性及其机制，实验结果表明，这2种化合物均具有较广泛分体外抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的先导化合物.本实验室［9］先前合成的化合物顺－6－氟－3－氯代亚甲基－硫色满－4酮可以显著抑制H22小鼠皮下移植瘤的生长，并延长S180腹水瘤小鼠的存活时间.

吡唑啉是重要的药物中间体［10－11］，其衍生物具有广泛的生物活性，如抗菌和抗肿瘤等［12］.邹敏等人合成了新的吡唑啉酮类化合物，生物活性测试表明，其中间体和目标产物都表现出很好的抑菌活性［13］.

3位取代的硫色满酮类化合物生物活性更好，并且吡唑啉类衍生物也具有抗肿瘤效果，所以本实验室以取代苯硫酚为起始材料，在3位引入吡唑啉类取代基，合成了一种新的化合物2，3，3a，4－二氢硫色并［4，3－c］吡唑啉（MDPE），结构式如图1.本文对MDPE 的体外和体内的抗肿瘤活性进行了研究.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂

MDPE固体分散剂由本实验室合成；注射用顺铂（齐鲁制药有限公司，批号：712058CF），用生理盐水制成1g／L，原液保存于4 ℃冰箱中，用前稀释至0.1g／L；RPM1－1640（北京索莱宝科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，ACS Grade，北京索莱宝科技有限公司）；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5 二苯基四氮唑溴盐（MTT，美国Amersco公司）；肝素钠（天津生物化学制药有限公司）；磷酸缓冲液（PBS）由本实验室配制.

1.1.2 实验动物及瘤株

昆明种小鼠18～22g，雌雄各半，由河北医科大学实验动物中心提供（合格证号：1212021）.实验前在室温18.5～22 ℃、相对湿度47%～60%环境中饲养1周.

人胃癌细胞（SGC7901），人肺癌细胞（A549），人宫颈癌细胞（Hela），人肝癌细胞（HepG2），小鼠肝癌细胞（H22）和小鼠肉瘤细胞（S180）均引自中国科学院细胞所.

1.2 方法

1.2.1 MTT 比色法

SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22和S180细胞培养于RPMI－1640培养液中（含10%灭活胎牛血清、100 U／mL青霉素、100μg／mL链霉素、50μmol／L 2－巯基乙醇、1mmol／L丙酮酸钠），并将细胞置于37℃，体积分数5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养.取对数生长期细胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化并离心.调整细胞浓度为105／mL，接种于96孔板，每孔加100μL，放入CO2培养箱中继续培养.12h后加入MDPE，使其终质量浓度为分别为0，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0μg／mL.阳性对照药物顺铂的终质量浓度为10μg／mL.24h后，加入5mg／mL的MTT 溶液20μL，继续培养4h，然后加入150μL的DMSO.随后，用酶标仪检测570nm 处的光密度值（OD 值），计算IC50.

1.2.2 MDPE对H22肝癌细胞小鼠皮下移植肿瘤的抑制作用

H22肝癌细胞在小鼠腹腔内传代7d，于无菌条件下取出腹水，经离心得下层细胞沉淀，经台盼蓝染色计数后，活细胞数大于98%，然后用生理盐水调整细胞浓度至2×107／mL，取0.2mL细胞悬液接种于小鼠腋部皮下.随机分为5组，接种肿瘤24h后开始给药.

1）阴性对照组（n＝12）空白溶剂，按体重灌胃给药，连续10d.

2）阳性对照组（n＝12）每天1mg／kg，按体重腹腔注射给药，连续10d.

3）MDPE（每天1mg／kg）（n＝12），按体重灌胃给药，连续10d.

4）MDPE（每天5mg／kg）（n＝12），按体重灌胃给药，连续10d.

5）MDPE（每天10mg／kg）（n＝12），按体重灌胃给药，连续10d.

每天用游标卡尺测量肿瘤的长短径，按公式1／2（ab2）（a、b分别为肿瘤的长短径）计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线［12］.末次给药24h后，处死各组小鼠，剥离肿瘤块，称取肿瘤质量，计算肿瘤抑制率：肿瘤生长抑制率＝（阴性对照组肿瘤质量－用药组肿瘤质量）／阴性对照组肿瘤质量×100%.

1.2.3 MDPE对H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠免疫系统的影响

末次给药后24h，眼睑取血测定外周血白细胞数.处死各组小鼠、称重、完整剥离肿瘤后，剪开胸骨，于心脏上方完整摘取2叶胸腺；剪开腹部，于左上腹取脾脏并将脾脏系膜剥离掉用滤纸将表面的组织液吸干后，称湿重，按以下公式计算胸腺指数和脾脏指数，评价其对免疫系统的作用

脏器指数＝（脏器重量／体重）×100%.

1.2.4 MDPE对H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠骨髓的影响

待小鼠内脏摘取完毕后，剥离股骨，取小鼠完整右侧股骨，用7号针在股骨膝关节端打一小孔，抽取3%冰醋酸溶液反复冲洗其骨髓细胞于10mL冰醋酸溶液内，4号针头过滤，充分混匀并计数.

取左侧股骨，用7号针头在股骨膝关节端打一小孔，用0.005mol／mL CaCl210mL 反复冲洗将骨髓冲入离心管中，于4°C保存.2 500r／min离心15min，弃上清液，将沉淀物加0.2mol／mL HClO45mL充分混匀，90°C加热15min，冷却，在260nm 处测定紫外吸收值A.按以下公式计算骨髓DNA 抑制率：

抑制率＝（1－用药组平均A 值／阴性对照组平均A 值）×100%.

1.2.5 MDPE对S180腹水瘤小鼠生命延长率的影响

无菌条件下，取腹腔内传代7d的S180肉瘤细胞，2 000r／min离心5min，弃上清液，下层沉淀物用生理盐水按1:3的体积比例稀释摇匀，经台盼蓝染色计数，活细胞数大于98%，并调整细胞数至2×107／mL，取0.2mL细胞悬液，接种于每只小鼠腹腔内.

小鼠接种肿瘤24h后，随机分为阴性对照组和MDPE不同剂量的给药组，每组12只，雌雄各半.

小鼠接种肿瘤24h后灌胃给药，MDPE给药组，剂量分别为每天1，5，10mg／kg；阴性对照组给予相同体积的空白溶剂.每天给药1次，连续给药10d.每天记录小鼠的死亡情况（小鼠存活超过30d按3d算），且按以下公式计算小鼠生命延长率：

生命延长率＝（用药组平均生存时间／阴性对照组平均生存时间－1）×100%.

1.3 数据统计

因SPSS 17.0软件对所有数据进行统计学处理，实验数据均以均数±标准差表示，且各组均数的比较采用单因素方差分析（One－Way ANOVA）.

2 结果与讨论

2.1 MDPE的体外抗肿瘤活性

在体外实验中，MDPE对SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22和S180细胞生长的抑制作用如图2，以直线回归方法得IC50分别为8.44，8.91，7.30，11.04，7.08和6.93μg／mL.结果显示：MDPE的抗肿瘤活性明显高于同浓度的顺铂，且随着给药浓度的增加，对肿瘤的生长抑制率也在增加.这说明MDPE 抗肿瘤活性高，也为体内抗肿瘤实验的研究提供了一定的依据.综合体外实验结果，选择H22和S1802种细胞进行体内实验研究.

图2 MDPE对SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22and S180细胞的生长抑制率Fig.2 Growth inhibition rates of MDPE on SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22and S180cells

2.2 MDPE对H22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤的影响

图3 H22皮下移植瘤的生长曲线Fig.3 Growth curves of H22transplanted subcutaneously models

MDPE 对H22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤的抑制作用如图3和表1.由图3可知，随着给药剂量的增加，MDPE 对肿瘤生长的抑制效果相应的增强，表现出一定的量效关系.MDPE（每天给药1，5，10mg／kg）3个给药组的肿瘤生长速度均小于阴性对照组和阳性对照组，表明MDPE 对H22肝癌细胞皮下移植瘤的生长有抑制作用，并且对肿瘤生长的抑制作用优于顺铂.由表1可知，随着给药剂量的增加，MDPE对H22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤的抑制率也相应的增加，呈现一定的量效关系.MDPE（每天给药1，5，10mg／kg）3个给药组的肿瘤抑制率分别为45.33%，50.16%，51.73%，肿瘤抑制效果优于阳性对照组（40.47%）.由肿瘤生长曲线以及肿瘤抑制率来看，MDPE可以抑制肿瘤细胞的生长，推测它可能是通过抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，进而发挥肿瘤抑制作用，其抗肿瘤机制有待进一步研究.

表1 MDPE对H22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤的抑制Tab.1 Inhibition of mice implanted tumor H22of MDPE

2.3 MDPE对H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠免疫系统的影响

MDPE对H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠免疫系统的影响如表2.MDPE 3个给药组中的白细胞数、胸腺指数、脾指数均高于阳性对照组.当MDPE给药组剂量为每天1mg／kg时，胸腺指数和脾指数均高于阴性对照组.表明腹腔注射给药MDPE能够刺激小鼠胸腺和脾脏的发育，有利于增强免疫功能.胸腺和脾都是免疫细胞存在的场所，所以推测MDPE可能是使免疫器官发生了免疫细胞的数目增多.据报道，CD4＋和CD25＋2种T细胞可以在胸腺中检测到，它们既可以抑制自身发生免疫疾病，也可以对肿瘤免疫进行调节，它们的抗肿瘤机制可能是抑制肿瘤免疫［14］.NK细胞是一种自然杀伤细胞，属于先天免疫系统的组成部分，可以抵御机体感染和防止细胞恶性转化［15］.NK细胞与T淋巴细胞有所不同，它是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞，不需要肿瘤特异性抗原识别，可以直接杀伤肿瘤细胞［16］.目前，被认可的NK细胞抗肿瘤机制包括3种：以孔素或粒酶介导的肿瘤坏死过程，由NK细胞与肿瘤直接接触而介导的细胞凋亡，NK 细胞破坏肿瘤微血管系统而引起的肿瘤出血坏死［17］.综上，MDPE对肿瘤的作用机制值得从免疫细胞方面进行更加深入细致的研究.

表2 MDPE对H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠免疫系统的影响Tab.2 Effects on immune system of H22transplanted subcutaneously models

2.4 MDPE对H22肝癌细胞小鼠骨髓的影响

H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠骨髓有核细胞数目见表3.MDPE（每天给药1，5，10mg／kg）3个给药组的骨髓有核细胞数目均高于阳性对照组，结果表明MDPE对骨髓的抑制作用小于顺铂，毒性比较低.

MDPE（每天给药1，5，10mg／kg）3个给药组的DNA 抑制率分别为8.68%，15.74%，17.44%，顺铂的DNA 抑制率为17.71%.据文献报道，顺铂是一种生物烷化剂，其作用机理非常明确.它主要通过引起DNA复制障碍，进而抑制肿瘤细胞的分裂［18］.从表3中可以看到，MDPE 给药组对DNA 也有一定的抑制率，且随着给药浓度的增加，DNA 抑制率也在增加，具有一定的量效关系.这说明，MDPE 对肿瘤的抑制作用也可能是通过影响肿瘤细胞的DNA 而发挥效果，其接下来的作用机理研究可以从DNA 方面出发，进行更加深入的研究.

表3 H22肝癌皮下移植瘤小鼠骨髓有核细胞的影响Tab.3 Effects on bone marrow nucleated cell of H22transplanted subcutaneously models

2.5 MDPE对S180腹水瘤小鼠生命延长率的影响

MDPE对S180腹水瘤小鼠生命延长率的影响见表4.从表4结果可以看出，与阴性对照组相比，MDPE（每天给药1，5，10 mg／kg）3 个给药组可以明显延长S180腹水瘤小鼠的存活时间，生命延长率分别为29.16%，56.66%，79.75%，且随着给药浓度的增加，生命延长率也在增加.说明，MDPE 能够延长S180腹水瘤小鼠生命和抑制S180腹水瘤生长，起到减毒增效的作用，其机理有待于进一步研究.

表4 对S180腹水瘤小鼠存活时间的影响Tab.4 Effects on survival time of the S180ascites tumor models

3 结论

体外实验显示：MDPE对SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22和S180细胞的抑制作用明显高于同质量浓度的顺铂，IC50分别为8.44，8.91，7.30，11.04，7.08 和6.93μg／mL.

体内实验结果表明：MDPE对H22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤有很好的抑制作用，以每天1，5，10mg／kg的剂量灌胃给药，肿瘤抑制率分别为45.33%，50.16%，51.73%；通过考察MDPE 对免疫系统以及骨髓的影响，证实MDPE毒副作用较小；并且MDPE可明显延长S180腹水瘤小鼠存活时间，每天以1，5，10mg／kg的剂量灌胃给药，生命延长率分别为29.16%，56.66%，79.75%.

实验结果表明，MDPE在体外和体内都有很好的抗肿瘤效果，值得进一步深入研究.

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