重楼皂苷促成骨样细胞MC3T3-E1增殖作用及其机制

许晓莲，李 勃

重楼皂苷促成骨样细胞MC3T3-E1增殖作用及其机制

许晓莲，李 勃

目的 研究重楼皂苷对成骨样细胞MC3T3-E1细胞增殖的作用及其机制。方法 培养成骨样细胞MC3T3-E1，加入不同浓度的重楼皂苷(3、10、30、100 μg/ml)，采用MTT比色试验法、EdU试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)活性检测法观察MC3T3-E1的增殖情况，以Western blot方法观察重楼皂苷 (30、100 μg/ml)对成骨样细胞中β-连环素(β-catenin)和骨形成蛋白-2 (BMP-2)表达的影响。结果 重楼皂苷可有效促进成骨样细胞MC3T3-E1的增殖(增殖率117.67～153.33)， 浓度依赖性地升高β-catenin与BMP-2的表达。结论 重楼皂苷可能通过调节β-catenin与BMP-2信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖与分化。

重楼皂苷；成骨样细胞MC3T3-E1；增殖；骨形态发生蛋白2；β-连环素

重楼又名“七叶一枝花”，为百合科植物，以根茎入药；主要分布于广西、贵州、四川、广东、浙江、江西等省，具有败毒抗癌、消肿止痛、清热定惊、镇咳平喘的功效。重楼主要针对痈肿肺痨久咳、跌打损伤、蛇虫咬伤、淋巴结核、骨髓炎等症，是云南白药的主要成分之一，其具生物活性的主要成分是多种甾体皂苷。目前中药重楼的研究主要集中于其抗肿瘤作用机制的研究[1,2]，鉴于其在消肿止痛与抗跌打损伤方面有良好的疗效，笔者推测重楼皂苷对运动系统(肌肉、骨骼)损伤修复具有积极的影响，并且具有防治骨质疏松症的可能。因此，本研究拟通过观察重楼皂苷对成骨样细胞MC3T3-E1增殖作用及对β-catenin与BMP-2表达的影响，初步阐明其在运动系统损伤治疗中的机制，并探讨重楼皂苷防治骨质疏松症的可能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 所用重楼为秦岭太白山野生药材，经鉴定为百合科(Liliaeeae) 重楼属 (Paris) 植物Paris polyphylla Smith var yunnanensis (Franch) Hand-Mazz的干燥根茎。小鼠MC3T3-E1成骨样细胞株 (中国科学院上海生化细胞所细胞库)，DMEM培养液(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亚砜(DMSO)、MTT(美国Sigma公司)，EdU试剂盒 (广州瑞博公司)，ALP试剂盒 (南京建成生物公司)，β-catenin ，BMP-2及β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养及药物处理MC3T3-E1 成骨细胞 MC3T3-E1细胞置于37 ℃、5% CO2细胞孵箱，在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。重楼皂苷以DMSO配置为1 g /L的母液， 置4 ℃冰箱保存，临用前稀释成工作浓度。MC3T3-E1 成骨细胞分为对照组及给药处理组(细胞增殖实验设置3、10、30、100 μg/ml 4个浓度；其他实验选择30、100 μg/ml 2个浓度)。

1.3 方法

1.3.1 重楼总皂苷的制备 参考蒋雪等[3]及孙治国等[4]的方法制备。简述如下：将重楼干燥粗粉(0.45 mm粒径)用30% 的乙醇溶液[粗粉质量与(浸泡)乙醇的体积比1∶15]浸泡36 h后，用频率为59 kHz的超声处理浸泡液，抽滤，洗涤30 min。合并滤液；药渣再重复一次前述过程，合并滤液，弃去药渣。减压蒸馏滤液得粗皂苷浓缩液，并上AB-8大孔树脂吸附柱，用水洗除杂，醇洗得纯化皂苷醇溶液，减压浓缩。浓缩液冷冻干燥，即为重楼总皂苷。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖率 取生长良好、处于对数增生期的MC3T3-E1细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板内，置于37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养12 h，使细胞充分贴壁后随机分组，每组设3个平行孔。对照组仅加入200 μl含0.54‰ DMSO的培养液，给药处理组则分别加入含各种浓度的重楼皂苷培养液 (3、10、30、100 μg/ml) 200 μl。继续培养24 h或48 h。取出培养板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，再继续孵育4 h，终止培养。弃去孵育液，每孔加入150 μl DMSO，于微量振荡仪上低速振荡10 min，待结晶物充分溶解后，在Bio-Rad酶标仪上检测各孔在490 nm波长处的吸光度。计算细胞增殖率：细胞增殖率(%)=(试验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值 × 100%。实验重复3次。

1.3.3 EdU试剂盒检测MC3T3-E1成骨细胞的增殖 细胞接种及给药流程与MTT法相同 (根据MTT结果，选择30、100 μg/ml两个促进细胞增殖最为明显的浓度)，待MC3T3-E1细胞与不同浓度的重楼皂苷 (30、100 μg/ml) 孵育48 h后，按照EdU试剂盒说明进行操作，使用尼康荧光显微镜采集图像，image软件进行分析。

1.3.4 碱性磷酸酶(ALP)活性测定 以2×104/孔的密度将MC3T3-E1细胞接种于24孔板内。待细胞贴壁(12 h)后，换用含不同浓度重楼皂苷(30、100 μg/ml) 的培养液，继续培养48 h或72 h。按照碱性磷酸酶试剂盒说明进行操作[5]。使用DU800型紫外分光光度计(美国Beckman公司)测定各组在520 nm处吸光度，计算ALP活力单位，同时测定每个样品的蛋白含量，结果用U/mg蛋白表示。

1.3.5 Western blot 法测定β-catenin与BMP-2的表达 细胞培养48 h后，以细胞刮刮取对照组和重楼皂苷各组 (30、100 μg/ml) 的细胞，加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制剂，碧云天公司)细胞裂解液提取总蛋白，用Bradford 法检测蛋白浓度。以30 μg/孔的量加入蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。NC膜用5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入β-catenin(1∶200)、BMP-2(1∶500)及β-actin(1∶500) 一抗,4℃过夜。洗膜3次后加入1∶6000稀释的相应HRP标记二抗，室温孵育1 h，充分洗膜后，ECL 法显影。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件中的方差分析(ANOVA)进行数据统计。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对MC3T3-E1成骨样细胞增殖的促进效应 与对照组相比，3、10、30、100 μg/ml的重楼皂苷作用于细胞24 h、48 h后均能促进成骨样细胞增殖(P<0.01，表1)。加入重楼皂苷(30、100 μg/ml)24 h后，MC3T3-E1细胞的增殖率分别为(137.33±3.79)%，(149. 67±6.51)% ；48 h后，分别为(147.33±7.64)%，(153.33±4.93)%。 EdU实验结果(图1)也表明重楼皂苷可以有效刺激成骨样细胞MC3T3-E1的增殖，Image J软件扫描结果表明：与对照组相比，重楼皂苷(30、100 μg/ml)处理组的增殖率升高(36.23±3.79 )%和(48.34±4.16)% (P<0.01)。

2.2 对成骨样细胞MC3T3-E1 ALP活性的促进效应 重楼皂苷 (30、100 μg/ml) 作用于细胞48 h或72 h后，细胞的ALP活性均显著升高。在48 h或72 h时，对照组细胞的ALP活性分别为：(0.22±0.05)，(0.23±0.04) U/mg蛋白。而加入重楼皂苷(30、100 μg/ml)48 h后，ALP活性分别为(0.33±0.06)，(0.40±0.02) U/mg蛋白；72 h后，分别为(0.34±0.05)，(0.48±0.06) U/mg蛋白。与对照组相比差异有统计学意义。

2.3 对上调MC3T3-E1细胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表达的作用 Western blot结果显示，与对照组相比，重楼皂苷(30、100 μg/ml) 作用于MC3T3-E1细胞48 h后，使得细胞中β-catenin和BMP-2的表达明显升高 (P<0.01)，呈现一定的浓度依赖性(图2)。

表1 重楼皂苷对成骨样细胞MC3T3-E1增殖的影响 (n=3;%)

注：与对照组比较,①P<0.01

图1 EdU检测重楼皂苷对成骨样细胞MC3T3-E1增殖的影响(Edu荧光染色，×200)

图2 重楼皂苷对成骨样细胞MC3T3-E1的β-catenin与BMP-2的蛋白表达水平的影响

3 讨 论

重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，味苦、微寒、有小毒、归肝经；具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等功效。现代药理研究发现本品提取物具有止血、抗炎、镇静镇痛等作用[6]。重楼在消肿止痛与抗跌打损伤方面有良效，是云南白药的主要成分之一，其主要化学成分为甾体皂苷，约占总化合物数目的80%。本研究表明：重楼皂苷通过上调β-catenin和BMP-2的蛋白表达，促进成骨样细胞MC3T3-E1的增殖，并上调其成骨活性，提示重楼皂苷在重楼促进运动系统(肌肉、骨骼)损伤恢复及防治骨质疏松中发挥了重要作用。

本研究中，MTT试验结果显示：重楼皂苷(3、10、30、100 μg/ml)对成骨样细胞MC3T3-E1增殖具有明显的促进作用，且该作用呈现时间、剂量依赖性关系。由于在30、100 μg/ml浓度时，重楼皂苷的促增殖作用尤为明显，所以后续实验均采用这两个浓度。EdU试验结果再次表明重楼皂苷可有效促进MC3T3-E1细胞增殖。随后，笔者选择ALP (ALP为成骨细胞分化时所分泌的一种酶，其活性与成骨细胞的成骨活性成正相关[5])考察重楼皂苷对MC3T3-E1成骨活性的影响，发现重楼皂苷显著上调了细胞中ALP活性。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，在骨骼损伤修复以及骨质发育中起到了关键作用。因此，上述结果提示：重楼皂苷促进成骨样细胞增殖可能在重楼促进运动系统(肌肉、骨骼)损伤修复中发挥重要作用。另外，成骨细胞的增殖在抗骨质疏松中扮演了重要角色，故本实验从分子水平对重楼皂苷促进MC3T3-E1细胞增殖的机制作进一步的探讨，以期初步阐明其作用机制并为重楼在促进运动系统损伤恢复及防治骨质疏松中的应用提供研究基础与线索。

Wnt/β-catenin通路在骨形成与骨代谢过程中发挥着关键作用。该通路中的核心分子β-catenin，可在细胞质与细胞核间自由穿梭。当β-catenin在胞质中积聚并穿梭进入核内，可激活Wnt通路下游的一系列靶基因，进而发挥调控细胞生长，促进成骨细胞发育及骨形成的作用[7,8]。骨形态发生蛋白(BMPs)能够诱导骨髓基质干细胞分化为成骨细胞。它参与调节成骨细胞的增殖、分化和凋亡，在成骨细胞的分化过程中发挥的作用尤为重要[9]。本研究中，Western blot结果表明：重楼皂苷能够有效地上调MC3T3-E1细胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表达。提示：重楼皂苷可能通过调节Wnt/β-catenin与BMP-2的通路活性促进成骨样细胞MC3T3-E1的增殖。具体的调节机制尚需进一步观察这两条通路中的其他分子变化进行阐明。

综上所述，本实验观察到重楼皂苷能促进成骨样细胞MC3T3-E1的增殖，并上调其成骨活性。鉴于成骨细胞在运动系统损伤修复中发挥的重要作用，笔者推测重楼中的皂苷部分可能通过促进成骨细胞的增殖与活性，促进损伤修复。此外，重楼皂苷上调了β-catenin和BMP-2的蛋白表达，这两个蛋白的增高表达在抗骨质疏松中发挥了重要作用。虽然重楼皂苷的骨保护作用仍需进一步阐明，但本实验结果为重楼皂苷在跌打损伤修复以及抗骨质疏松中的应用提供了一定实验依据。

[1] 金炜东, 陈孝平, 蔡红娇, 等. 重楼提取物对HepG2细胞的毒性作用 [J].华中科技大学学报 (医学版), 2006,35(1):103.

[2] 许 玲,刘嘉湘.益肺抗瘤饮对肺癌转移及免疫功能的影响 [J].中国中西医结合杂志,1997,17(7):401.

[3] 蒋 雪, 张经硕, 邱 敏. 重楼皂甙提取工艺优化与近红外光谱在线质量控制 [J]. 分析化学, 2006, 34 (U09): S171-S174.

[4] 孙治国, 张 琳, 李凌军. 重楼总皂苷提取工艺研究[J].中药材, 2007,30(6):726-729.

[5] 范焕琼，崔 燎. 丹酚酸B对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响[J]．中国药理学通报，2008,24(7): 978-979．

[6] 国家药典委员会.中国药典Ⅰ部 [S].北京：化学工业出版社, 2005:183.

[7] Day T F, Guo X, Garrett-Beal L. Wnt/beta-catenin signaling in mesenchymal progenitors controls osteoblast and chondrocyte differentiation during vertebrate skeletogenesis [J]. Dev Cell, 2005, 8(5):739-750.

[8] Regard J B, Zhong Z, Williams B O. Wnt signaling in bone development and disease: making stronger bone with Wnts [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012, 4(12):1-17.

[9] Jang W G, Kim E J , Kim D K. BMP2 protein regulates osteocalcin expression via Runx2-mediated Atf6 gene transcription [J]. J Biol Chem, 2012, 287(2):905-915.

(2013-08-26收稿 2013-12-15修回)

(责任编辑 梁秋野)

Effect of polyphyllins on proliferation of osteoblast-like cells MC3T3-E1 and its possible mechanisms

XU Xiaolian and LI Bo.

Department of Pharmacy, Shanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054, China

Objective To investigate the effect of polyphyllin on the proliferation of osteoblast-like cells MC3T3-E1 and possible mechanisms. Methods The osteoblast-like cells MC3T3-E1, were administered with different concentrations of polyphyllin (3, 10, 30, and 100 μg/ml). Then, MTT colorimetric test, EdU kit, and alkaline phosphatase (ALP) activity detection kit were used to observe the proliferation of MC3T3-E1. Western blot analysis was employed to observe the expression of β-catenin and bone morphogenetic protein -2 (BMP-2) in MC3T3-E1 cells treated with 30, and 100 μg/ml of polyphyllin. Results Polyphyllin could effectively promote proliferation of MC3T3-E1 cells and upregulate the expression of β-catenin and BMP-2 expression. Conclusions Polyphyllin may promote MC3T3-E1 cell proliferation and differentiation via regulating β-catenin and BMP-2 signaling pathway.

polyphyllin; osteoblast-like cells MC3T3-E1; proliferation; bone morphogenetic protein 2; β-catenin

许晓莲, 本科学历，副主任药师，E-mail: xuxiaolian1017@163.com

710054西安，武警陕西总队医院药剂科

R915