蟾毒灵镇痛作用及其作用机制探讨

杨 光，杨 宇，张玉杰，曾宪阳

蟾毒灵镇痛作用及其作用机制探讨

杨 光，杨 宇，张玉杰，曾宪阳

目的 研究蟾毒灵的镇痛作用及其作用机制，为其临床应用提供理论依据。方法 通过醋酸诱发小鼠扭体反应实验和小鼠热板实验，研究蟾毒灵的镇痛作用，通过Griess法和免疫印迹法研究RAW264.7细胞中NO含量和MAPK/p38/iNOS通路的变化。结果 蟾毒灵(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg)可以剂量依赖性地减少醋酸所致的小鼠扭体数(P<0.05)，并可显著提高热板所致疼痛小鼠痛阈值(P<0.05)。体外研究表明蟾毒灵(0.04 μM, 0.08 μM)可显著降低脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞的NO含量升高(P<0.05)，并可以抑制RAW264.7细胞的MAPK/p38/iNOS信号通路的激活。结论 蟾毒灵具有一定的镇痛作用，其镇痛机制可能与抑制MAPK/p38/iNOS通路，继而减少NO的合成和释放有关。

蟾毒灵；镇痛；一氧化氮；MAPK通路

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)和黑眶蟾蜍(Bufo melanost ictus Schneider)耳后腺的分泌物[1]。其性味甘辛、温，有毒，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用[2]。近年来对蟾酥及有效成分的研究表明，蟾毒灵(Bufalin)是发挥药效的主要成分之一[3,4]。本研究针对蟾毒灵的镇痛作用进行研究，并初步探讨了其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与实验动物 受试药与动物分组 YLS-6B 智能热板仪(山东省医学科学院设备站)；多功能酶标仪(美国Biotek公司)。蟾毒灵(美国Sigma公司)；吲哚美辛肠溶片(江苏亚邦爱普森药业有限公司)。L-硝基精氨酸甲酯( L-NAME)，购自美国 Sigma 公司；NO试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库。p38、phosphorate-p38、iNOS、β-actin抗体购自美国Cell Signaling公司。昆明种小白鼠40只(体重18～20 g，购自于中国医科大学实验动物中心)，随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组(给予相同体积的生理盐水)，阳性对照吲哚美辛组(10 mg/kg，灌胃给药)，蟾毒灵各剂量组(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg，腹腔注射)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠醋酸扭体法 4组小鼠给药后1 h腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 ml/只。观察并记录15 min内出现扭体反应的次数，计算扭体抑制率。

扭体抑制率(%)=(空白对照组扭体均数-给药组扭体均数)/空白对照组扭体均数×100%[5]。

1.2.2 小鼠热板法 将小鼠置于55 ℃的热板上，以放置于热板上至出现小鼠舔后足所需的时间(s)为该鼠的正常痛阈值。选择正常痛阈值在5～30 s内的小鼠(喜跳跃的小鼠认为不合格)进行实验。给药前首先重复测定小鼠的正常痛阈值，取2次正常痛阈值的平均值为该小鼠的给药前痛阈值，然后分别腹腔注射给药，于给药后30、60、90、120、150 min再测小鼠的痛阈值，若小鼠60 s内仍没有出现舔后足的现象，则立即将小鼠取出，痛阈值按60 s计，并按照公式计算其痛阈提高百分率：

痛阈提高率(%)=(给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值)/给药前平均痛阈值×100%[5]

1.2.3 NO的检测 RAW264.7细胞按2×105/孔接种于96孔板中，每孔100 μl，贴壁4 h后，加入蟾毒灵(0.04 μM，0.08 μM)，正常对照孔或模型对照孔加入等体积的培养液，孵育2 h，再加入50 μl终浓度为10 μg/L的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激(正常对照孔加入等体积培养液)24 h，Griess法测定上清中NO的含量，用以反映NO水平。L-NAME(终浓度为200 μM)作为阳性对照药物。

1.2.4 免疫印迹 实验分4组：对照组、LPS组、蟾毒灵(0.04、0.08 μM)+ LPS组, 蟾毒灵预先加入RAW264.7细胞作用2 h，加入LPS 10μg/L作用24 h，弃去上清，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution ，PBS)洗涤2次，加入预冷的细胞裂解液，然后提取蛋白。蛋白定量后取20 μg蛋白质进行10%SDS-PAGE，转PVDF膜后，用脱脂奶粉室温封闭60 min，加入一抗过夜，然后二抗37 ℃孵育1 h。加入化学发光试剂(electrochemiluminescence， ECL)显色液，置于凝胶成像仪中观察并分析结果，CCD自动获取图像，同时小鼠β-actin作为内参照[6]。

方差分析判断总体显著性差异，组间资料采用LSD 或Games-Howell检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 扭体反应结果 蟾毒灵(0.5、1.0 mg/kg)给药1 h后，可以剂量依赖性地减少醋酸所致的小鼠扭体数(P<0.05)，其中低剂量组的抑制率为30.8%，高剂量组的抑制率可达到48.0%。高剂量的镇痛作用与阳性药吲哚美辛(抑制率为51.4%)基本相当(表 1)。

表1 蟾毒灵对实验小鼠扭体反应的影响 ±s)

注：与对照组相比,①P<0.05

2.2 热板实验结果 蟾毒灵(0.5、 1.0 mg/kg)给药后30 min可以提高小鼠的痛阈值(P<0.05)，痛阈值提高百分率分别为38.3%和50%。90 min时达到峰值，痛阈值提高百分率分别为82.8%和117.7%。镇痛效果持续到给药后120 min，痛阈值提高百分率分别为46.4%和83.3%(表2)。与阳性药吲哚美辛比，其强度稍弱，但作用维持时间长。结果提示，蟾毒灵对热板所致疼痛镇痛作用强。

表2 蟾毒灵给药前、后不同时间对实验小鼠痛阈值的影响 ±s)

注：与对照组比较,①P<0.05

2.3 蟾毒灵对巨噬细胞RAW264.7细胞NO释放的影响 在10 μg/L的LPS刺激下，RAW264.7细胞释放NO的量增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，表明LPS能明显诱导RAW264.7细胞释放NO，而蟾毒灵对激活状态RAW264.7细胞NO释放有抑制作用，并呈良好的剂量依赖关系(表3)。

表3 蟾毒灵对RAW264.7细胞一氧化氮(NO)释放的影响 ；μM)

注：与对照组比较①P<0.05; 与LPS组比较,②P<0.05

2.4 对巨噬细胞RAW264.7细胞MAPK/p38/iNOS通路的影响 在10 μg/L的LPS刺激下，RAW264.7细胞p38磷酸化增加，iNOS表达上调，表明LPS能激活RAW264.7细胞MAPK/p38/iNOS通路，加入蟾毒灵后可以剂量依赖性的抑制p38激活，并下调iNOS的表达水平。蟾毒灵对激活MAPK/p38/iNOS通路有抑制作用，并呈剂量依赖关系(图1)。

图1 蟾毒灵对RAW264.7细胞MAPK/p38/iNOS

3 讨 论

蟾毒灵是从蟾酥中分离得到的活性较高的单体成分，近年来报道显示其具有显著的抗肿瘤活性作用[2,3]。有报道蟾毒灵能够显著抑制醋酸引起的小鼠扭体次数，还可明显延长热刺激所致小鼠痛觉反应时间，这说明蟾毒灵具有一定的镇痛作用[4]。然而，目前对其镇痛机制至今还不是很清楚。

醋酸扭体法和热板法是两个经典的评价镇痛药效果的实验方法。本研究采用两种方法，对不同剂量的蟾毒灵进行了镇痛药效评价，以期进一步证明蟾毒灵的镇痛药理效果。醋酸扭体实验结果显示，蟾毒灵给药后，可以剂量依赖性的减少醋酸所致的小鼠扭体数，高剂量的镇痛作用与阳性药吲哚美辛基本相当。热板实验结果显示，蟾毒灵给药后短时间内即可提高小鼠的痛阈值，镇痛效果持续到给药后120 min，与阳性药吲哚美辛比其强度稍弱，但作用维持时间长。本研究结果提示蟾毒灵具有良好的镇痛作用，且具有作用维持时间长的药理特点。

NO是一种重要的信息传递物质和神经递质，近年来的研究表明NO参与痛觉调制，并可促进疼痛传入和致痛介质的释放，同时还可以促进脊髓痛觉过敏形成和脑内痛觉信息的加工[7-9]。本研究结果还发现，蟾毒灵可以剂量依赖性的抑制LPS诱导的NO释放，这就提示蟾毒灵可能通过抑制NO的释放，达到抑制疼痛传入和致痛介质的释放过程，继而减轻疼痛症状。MAPK/p38信号通路是细胞内重要的信号通路，除了参与细胞的增殖、分化外，还参与炎性递质的释放，而细胞内负责合成NO的诱导性一氧化氮合酶(iNOS)就是其重要的靶基因[10,11]。本研究结果发现，炎性介导物质LPS可以诱导MAPK/p38信号通路激活，继而促进iNOS表达增加。而蟾毒灵可以剂量依赖性的抑制LPS诱导的p38磷酸化及iNOS的表达，这说明抑制MAPK/p38通路可能是蟾毒灵减轻疼痛作用的上游靶点。

综上所述，可以发现蟾毒灵对两种不同的致痛方法诱发的疼痛均有较强的镇痛作用，表明其镇痛机制是多方面的，可能与抑制MAPK/p38/iNOS通路，继而抑制NO释放相关，但其确切的镇痛机制有待进一步研究。

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(2013-10-11收稿 2013-12-20修回)

(责任编辑 郭 青)

A study on analgesic effect of bufalin and its underlying mechanisms

YANG Guang，YANG Yu，ZHANG Yujie, and ZENG Xianyang.

Department of Anesthesiology ,Liaoning Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces. Shenyang 110034, China

Objective To investigate the analgesic effect of bufalin and its underlying mechanisms. Methods The analgesic effect of bufalin was studied by the acetic acid-induced writhing response and hot plate test. The contents of NO and the activation of MAPK/p38/iNOS pathway in LPS-induced RAW264.3 were measured by Griess assay and Western blotting, respectively. Results Bufalin (0.5， 1.0 mg/kg) showed a significant inhibition of acetic acid-induced writhing response and prolonging of licking time in hot plate test at a dose-dependent manner (P<0.05). Bufalin (0.04, 0.08 μM) significantly reduced the contents of NO and inhibited the activation of MAPK/p38/iNOS in RAW264.7 cells. Conclusions The analgesic of bufalin is related to suppressing the activation of MAPK/p38/iNOS pathway and subsequently reducing the synthesis and releases of excessive NO.

bufalin；analgesia；NO；MAPK pathway

杨 光，本科学历，主任医师，E-mail: 2000volare@sina.com

110034沈阳，武警辽宁总队医院麻醉科

杨 宇，E-mail: 2000volare@sina.com

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