白内障蛋白质组学研究的现状及未来研究方向△

刘平 苏胜

白内障蛋白质组学研究的现状及未来研究方向△

刘平 苏胜

晶状体；白内障；蛋白质组学

白内障——眼睛晶状体混浊，是人类致盲的最主要原因，约占所有病例的42%。晶状体内富含晶状体蛋白(占所有蛋白的90%)，其结构和功能异常是白内障形成的重要原因。新近研究表明，大量晶状体蛋白发生了翻译后修饰、相互聚集以及自身降解，这些变化的累积导致白内障的形成。这些传统的蛋白质组学研究主要以高丰度的晶状体蛋白为研究对象，阐述了白内障可能的发病机制。然而，对于晶状体内的非晶状体蛋白，由于含量微少(但功能重要)，目前的蛋白质组学研究受阻，进展缓慢。因此，有必要分析晶状体的特殊性以及非晶状体蛋白的作用，来推动白内障蛋白质组学研究。

[眼科新进展，2014，34(1)：1-4]

白内障的病因和发病机制一直是研究的热点。蛋白质组学的出现，使白内障的基础研究取得了极大发展。晶状体是一个细胞器官，它的透明性和稳定性是通过把晶状体蛋白紧密排列成玻璃样微结构来实现的[1]。任何影响蛋白质这种结构和功能的改变都可能产生白内障。晶状体是体内蛋白质含量最高的组织(占湿重的35%)，同时缺乏细胞器和核酸，因此，白内障是最理想的蛋白质组学研究模型。晶状体内的蛋白质90%为结构性蛋白——晶状体蛋白，包括α、 β和 γ三个家族。晶状体蛋白的翻译后修饰(post-translational modifications,PTM)、相互聚集以及自身降解，引起晶状体蛋白结构的改变，可能是白内障形成的直接原因。而更早期的改变可能是晶状体内某些蛋白的功能失调。这些功能性蛋白，如骨架蛋白、膜蛋白、转运蛋白、代谢相关蛋白等，属于非晶状体蛋白，数目众多但含量微少，相关蛋白质组学研究进展缓慢。然而，这些蛋白的功能对保持晶状体稳态和透明性至关重要，他们的改变很可能是白内障发生的始动因素，值得深入研究。

1 研究现状

1.1PTM与白内障由于缺乏细胞器，晶状体内的蛋白几乎不能更新。随着时间的累积，这些晶状体的蛋白要经历大量的PTM，多种生理、环境以及遗传因素能够加速PTM的发生，PTM诱导晶状体蛋白的高级结构发生改变，导致晶状体混浊[2-3]。晶状体蛋白发生的PTM种类繁多，常见的有氧化、磷酸化、乙酰化、脱酰胺、糖基化、甲基化等。有些PTM属于晶状体蛋白加工的过程，在婴儿晶状体内就已存在，提示这些PTM与晶状体蛋白的发育或保护有关[4-5]。而更多的PTM发生在17岁以后，在老年晶状体内，发生PTM的晶状体蛋白水溶性降低，大量晶状体蛋白开始由水溶性变成水不溶尿素溶性，最后变成尿素不溶性。这些不溶性蛋白质在晶状体内蓄积，形成白内障。

氧化作用是晶状体蛋白发生PTM的常见类型，对氧化作用最敏感的是半胱氨酸(Cys)残基，此外发生氧化作用的还有甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)。正常晶状体内富含还原型谷胱甘肽(GSH)，可以对抗氧化损伤[6]。但是，随年龄的增长或在特殊环境(氧化应激)下，GSH逐渐被氧化且含量减少，一方面氧化作用产物形成二硫键，使晶状体蛋白相互交联，溶解度降低；另一方面，GSH的减少使晶状体蛋白氨基酸残基更容易发生氧化作用。过氧化氢诱导白内障模型的研究显示，晶状体蛋白在白内障形成以前，发生了一系列氧化改变，包括二硫键的形成、溶解性丧失及高相对分子质量(high molecular weight,HMW)蛋白质聚集[7]。在激素性白内障模型中，也有类似的改变[8]。磷酸化也是晶状体蛋白常见的PTM类型，最容易发生磷酸化修饰的蛋白是β-晶状体蛋白的两种亚基(βB1和βB2)，而丝氨酸(Ser)是最容易发生磷酸化的残基[9]。磷酸化的晶状体蛋白溶解性下降，α-晶状体蛋白发生磷酸化修饰后还可能丧失分子伴侣活性，进而不能抑制其他蛋白质变性，诱发白内障。乙酰化和脱酰胺的晶状体蛋白蓄积，可能破坏蛋白-蛋白相互作用，降低他们的稳定性，由此导致不溶性晶状体蛋白的蓄积[10]。由于晶状体内缺乏各种细胞器，通常不易发生较复杂的修饰，如糖基化，但是在糖尿病性白内障晶状体，非酶糖化作用普遍存在。糖基化的过程首先是开链的葡萄糖的醛基和蛋白质氨基酸上的游离氨基结合生成不稳定的Schif 碱和Amadori 产物，进而形成不可逆的晚期糖基化终末产物(advanced glycation endoproducts，AGEs)，AGEs 堆积导致晶状体蛋白变性交联[11]。与上述PTM不同，甲基化修饰的Cys残基，能够保护Cys免受氧化损害，GSH受到保护，晶状体蛋白的交联也受到抑制，因此Cys的甲基化具有抑制白内障形成的作用。

1.2蛋白质聚集与白内障晶状体蛋白在人的一生中要经历大量的修饰，这些修饰可以导致异常的蛋白-蛋白相互作用，进而引起蛋白聚集，最终导致晶状体混浊。有研究显示，晶状体蛋白的多聚体存在于白内障和正常老年晶状体的HMW蛋白成分中，这些多聚体主要通过非共价键结合[12]。也有以共价键结合的晶状体蛋白多聚体，主要存在于老年晶状体的水不溶性蛋白成分中[13]。晶状体内α-晶状体蛋白分子既可以和 β-、γ-晶状体蛋白一样作为结构性蛋白存在，又具有保护晶状体蛋白、防止聚集的分子伴侣的作用[14]。利用重组蛋白进行的研究证实了 αA- 和 αB-晶状体蛋白可以与许多部分变性的蛋白质相互作用[15]，抑制他们的聚集。

我们对年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)和正常晶状体进行研究，发现αA-、αB-、βA3-、βA4-、βB1-、γD-晶状体蛋白以及DKFZp434A0627在ARNC样品中的含量明显减少[16],但是未发现含量增多的晶状体蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳联合液相色谱串联质谱分析发现，减少的这部分晶状体蛋白在ARNC形成过程中发生了聚集，形成了不可逆的HMW聚集体[17]。这种聚集体的相对分子质量远大于在老年晶状体中发现的多聚体[18]，提示这种大分子的聚集体与ARNC密切相关。αA- 和αB-晶状体蛋白在聚集体中含量很高(αA-晶状体蛋白含量最高)，提示α-晶状体蛋白和其他晶状体蛋白之间可能存在交联。当α-晶状体蛋白聚集成一个比较大的复合物，可能丢失分子伴侣的功能，进而导致β- 和γ-晶状体蛋白聚合物的增加。因此，目前关于年龄相关性白内障最有依据的假说是，随着时间的推移，其他晶状体蛋白将会展开和/或者发生修饰后展开，逐渐耗尽α-晶状体蛋白的分子伴侣功能，逐渐引起蛋白质聚集体的形成[19]。另外，在激素诱导的大鼠白内障晶状体中，我们也检测到HMW α-晶状体蛋白聚集体，并且伴随着分子伴侣活性的降低[20]，提示α-晶状体蛋白保护作用的降低及聚集体的形成，可能是多种类型白内障形成的共同原因。

1.3蛋白质降解与白内障晶状体蛋白的降解与多种因素有关，可能由于蛋白水解酶的激活[21],非酶机制也可能产生晶状体蛋白片段[22]。各种氧化应激作用产生的解折叠和变性的蛋白质，一部分通过α-晶状体蛋白的修复恢复正常，有些无法修复的晶状体蛋白则需要通过降解来清除。晶状体内的蛋白酶体和泛素系统参与发生氧化的蛋白或肽段的清除[23]。尽管有这种清除机制，发生截断的蛋白/短肽仍可能在晶状体内蓄积，原因是截断的蛋白/短肽产生过量，且降解系统不能完全解体晶状体蛋白的片段[24]。早期的研究发现，晶状体内存在大量的晶状体蛋白的片段[25]，他们与晶状体蛋白相互作用，发生修饰后形成共价键结合的聚集体[13]。Santhoshkumar等[26]发现，在年轻、年老及白内障晶状体内都存在小的晶状体蛋白的片段(相对分子质量<3500)。随着年龄的增加，这种片段逐渐增多，并能引起光的散射。在ARNC晶状体中，除了小的晶状体蛋白片段，还存在大量较大的α-和β-晶状体蛋白的片段(相对分子质量10 000 ～ 19 000)，他们的数量可能远远超出降解系统的分解能力，这些未完全降解的片段与正常晶状体蛋白发生异常的相互作用，再加上PTM的累积，逐渐发生共价交联，形成不可逆聚集体，白内障随之形成[17]。

2 未来研究方向

蛋白质组学技术是一种非常有用的研究手段，其用于白内障发病机制的研究已经取得了丰硕的成果。晶状体是一个特殊的器官，一方面晶状体蛋白含量很高，相对容易研究，相关研究成果也显著；另一方面晶状体蛋白含量太高，足以掩盖非晶状体蛋白，相关研究进展缓慢。未来研究的方向是，根据晶状体内蛋白的特性，改进蛋白质组学技术，探索非晶状体蛋白在白内障形成中的作用。

2.1非晶状体蛋白传统的蛋白质组学研究通过双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)联合质谱分析，获取了多个物种标准的晶状体蛋白图谱。但是，这些研究主要聚焦于含量丰富的晶状体蛋白，几乎未能获取非晶状体蛋白信息。因为这些非晶状体蛋白含量微少，相对分子质量多大于35 000,在以优化晶状体蛋白分辨率为目的而改进的2-DE图谱上通常不能显示。然而，这些非晶状体蛋白也具有重要作用，例如肌动蛋白(actin)、微管蛋白(tubulin)以及膜收缩蛋白(spectrin)有助于维持透明细胞结构[27]；谷胱甘肽氧化还原酶、热休克蛋白以及晶状体蛋白多聚体参与形成HMW聚集体[28]；参与代谢的各种酶类在晶状体内的作用还不清楚。了解这些蛋白的作用对于研究白内障形成的分子机制至关重要，并且可能为未来的治疗提供有价值的信息。

Guest等[7]最先对非晶状体蛋白进行了2-DE研究，成功获取了肌动蛋白(actin)、微管蛋白(tubulin)、膜收缩蛋白(spectrin)、波形蛋白(vimentin)、晶状体特异性丝状蛋白C(filensin和phakinin)这些细胞骨架蛋白的信息。热休克蛋白71、WD-repeat蛋白1以及一些酶类，包括α烯醇化酶、丙酮酸激酶、酮糖转移酶、醛糖还原酶也成功从大鼠晶状体组织中鉴定出来。我们新近的研究证实了3-磷酸甘油醛脱氢酶、视黄醛脱氢酶1以及碳酰还原酶1含量的减少可能参与或加速ARNC的形成[16,29]。未来的研究应该致力于非晶状体蛋白在白内障发生前的变化，这有助于寻找白内障发生的标志物。

2.2针对晶状体的蛋白质组学方法改进虽然晶状体是进行蛋白质组学研究的理想组织，但晶状体的特殊性，也极大困扰着蛋白质组学研究者。晶状体内含有大量的晶状体蛋白，它们的存在严重干扰了非晶状体蛋白的检出，更无法研究他们的功能及病理情况下的改变。

蛋白质组学的发展很大程度上依赖技术的进步，高分辨率的2-DE技术和生物质谱的有机结合是目前应用最广泛且最成功的蛋白质组学技术。另一种广泛应用于蛋白质组学研究的分离技术是液相色谱法，它与质谱结合，实现了高通量筛选和鉴定蛋白质混合体系的要求。这些方法对于晶状体蛋白的研究堪称完美，但也因晶状体蛋白的高丰度掩盖了非晶状体蛋白，使他们很难被检测到。即便是最近发展起来的同位素标记相对和绝对定量分析(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)，尽管很灵敏，但是也受到高丰度蛋白的制约，难以应用于白内障研究。

对现有的蛋白质组学研究方法进行改进，势在必行。Guest等[7]最先进行了尝试，在研究大鼠晶状体时，通过SYPRO Ruby荧光染色提高2-DE敏感性、通过低上样量获取晶状体蛋白(相对分子质量<35 000)高分辨率图谱、通过高上样量获取非晶状体蛋白(相对分子质量>35 000)图谱，成功鉴定出了一些非晶状体蛋白。若患者年龄较大，晶状体蛋白PTM以及HMW聚集体广泛存在[18]，加大上样量后，2-DE图谱上非晶状体蛋白会被掩盖。不过，鉴于晶状体蛋白和非晶状体蛋白在相对分子质量上的差异，用荧光标记进行2-DE后，通过分区域扫描成像，或许可以达到相似的效果。基于同位素标记的iTRAQ技术，也可以利用两种类型蛋白的相对分子质量差异，先通过SDS-PAGE进行分离，取相对分子质量>35 000的凝胶，酶解后提取肽段，进行同位素标记，便可去除高丰度晶状体蛋白的影响。目前的问题是，从凝胶中提取肽段的方法需要反复优化，最大程度提高提取的效率。此外，晶状体蛋白种类不多，理论上可以通过抗体的特异性结合，达到去除高丰度蛋白的目的，以便有效地研究非晶状体蛋白。这种方法还有一个优点——抗体还可以结合HMW聚集体[16]，能够去除晶状体蛋白聚集体对检测的影响。缺点是晶状体蛋白含量极高，需要耗费大量抗体，花费巨大。此外，目前还没有相关方案的报道，需要去尝试和探索。

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date：Oct 15,2013

National Natural Science Foundation of China (No:30973275)From theEyeHospital,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,HeilongjiangProvince,China

Current situation and future directions of proteomic studies in cataract

LIU Ping,SU Sheng

lens;cataract;proteomics

Cataract,the opacification of the eye lens,is the leading cause of blindness worldwide-it accounts for approximately 42% of all cases.The lens contains highly abundant structural proteins crystallins (up to 90%).Malfunction of the crystallins plays a great role in the formation of cataract.Recent studies showed that large amount of crystallins suffer post-translational modifications,aggregation,and degradation,which result in decrease of the lens transparency.These traditional proteomic studies predominantly focused on the abundant crystallin proteins,and elaborated the potential pathogenesis of cataract.However,for non-crystallin proteins within the lens,because of the meager contents (but functionally important),the current proteomic research is blocked,and the progress is slow.Therefore,it is necessary to analyze the characteristic of the lens as well as the role of non-crystallin proteins to promote proteomic studies in cataract.

刘平，男，主任医师，教授，博士研究生导师。中华医学会眼科专业委员会委员，中华医学会眼科专业委员会白内障学组委员，中华医学会眼科专业委员会防盲学组委员。研究方向：角膜病、晶状体疾病的基础与临床研究。联系电话：0451-85553923 (O);E-mail:pingliuhmu@126.com

AboutLIUPing:Mail.Medical doctor.Tel:+86-451-85553923 (O);E-mail:pingliuhmu@126.com

2013-10-15

国家自然科学基金资助(编号：30973275)

150001 黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院

刘平，苏胜． 白内障蛋白质组学研究的现状及未来研究方向[J]． 眼科新进展，2014，34( 1) : 1-4．

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10． 13389 /j． cnki． rao． 2014． 0001

修回日期：2013-11-18

本文编辑：付中静

Accepteddate:Nov 18,2013

[RecAdvOphthalmol，2014，34(1):1-4]