石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

潘鑫艳，王 丽，杨长绍，黎贵芸，杨举伦，蔡 琳

石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

潘鑫艳，王 丽，杨长绍，黎贵芸，杨举伦，蔡 琳

目的 探讨石蜡包埋的10%硝酸脱钙骨组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证。方法 以20例石蜡包埋、10%硝酸脱钙的坏死性肉芽肿炎疑为骨结核的组织标本为研究对象，常规法直接采用德国QIAGEN公司的QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit方法提取DNA，而改良法中加入QIAamp®DNA Micro Kit试剂盒中的carrier RNA，以两种方法分别提取20例标本中结核杆菌DNA，通过荧光定量PCR，比较常规试剂盒提取法和改良提取法对结核杆菌检测结果的影响。结果 改良法提取的DNA[(35.32±3.48)ng/μl]比常规法[(6.68±3.72)ng/μl]提取的DNA显著增多(P<0.05)，改良法提取的DNA经荧光定量PCR检测结核杆菌的阳性率(55%)明显高于常规法(15%，P<0.01)。结论 改良法提取石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA具有高效简便的特点，是较为理想的方法，值得在puncture和极微小石蜡样本中推广。

脱钙骨组织；结核杆菌DNA；荧光定量PCR

目前，骨结核的诊断主要有影像学和血沉检查。而近年来，随着分子生物学技术的不断发展，荧光定量PCR成为检测结核分枝杆菌应用最多的方法[1-2]。但是，石蜡包埋组织中结核杆菌DNA的检测本身就仍然存在诸多问题[3]，石蜡包埋样品PCR扩增成功率很低，原因之一是模板DNA的质和量不够[4]。有文献报道了石蜡包埋的肺、淋巴结等其他骨外组织中结核杆菌DNA提取[5]及荧光定量PCR检测[6]。对于石蜡包埋脱钙的骨组织中结核杆菌DNA提取及检测报道较少，同时由于骨组织经过硝酸等脱钙处理后，DNA受到严重破坏降解，造成提取的DNA质量比一般石蜡包埋组织中的更差，从而严重影响骨组织中结核分枝杆菌的检测。因此，本研究从实际应用从发，寻找石蜡包埋脱钙骨组织中检测结核杆菌DNA的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本 收集我科2012～2013年的骨组织标本20例，所有骨组织标本均经10%硝酸脱钙24 h以上，经病理医师诊断为坏死性肉芽肿炎，考虑结核。每例标本切片8 μm×20片，每10片放入一个1.5 ml的无菌离心管中，分成2组，每组20例。

1.1.2 主要试剂 QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit(Cat.NO.56404)、QIAamp®DNA Micro Kit(Cat.NO.56304)、结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒，均购于德国QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 标本预处理 两组样本每管加入1.2 ml二甲苯脱蜡3次；无水乙醇重复3次，去除二甲苯；55 ℃恒温器干燥组织。每管加入180 μl试剂盒(QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit)中ATL和20 μl蛋白酶K，56 ℃水浴过夜(12 h以上)消化。

1.2.2 DNA提取 (1)常规QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit试剂盒提取法:消化过夜的样品置于90 ℃水浴1 h以灭活蛋白酶K，短暂离心后迅速加入200 μl BufferAL和200 μl无水乙醇，充分混匀，短暂离心。后续步骤按照QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit 说明书进行。(2)改良QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit 试剂盒提取法:消化过夜的样品置于90 ℃水浴1 h以灭活蛋白酶K，短暂离心后按照200∶1的比例每管迅速加入AL和QIAamp®DNA Micro Kit试剂盒中特有的carrier RNA，上下颠倒混匀，加入200 μl无水酒精，继续按照1.2.1中QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit试剂盒说明书中的后续步骤提取基因组DNA。

1.2.3 DNA质量检测 上述提取的石蜡包埋脱钙骨组织中基因组DNA，分别取2 μl，用紫外分光光度计测量两组样品DNA的浓度、纯度。

1.2.4 荧光定量PCR检测 (1)PCR扩增:PCR扩增体系为40 μl，配制按照结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒说明书操作步骤进行，体系放入荧光定量PCR仪(Bio-rad CFX96)中检测和数据分析。每批检测标本均设置阳性、阴性对照。PCR反应参数：37 ℃，5 min；94 ℃，1 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；循环40次，使用荧光定量PCR仪检测，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设置在60 ℃。(2)判读标准:检测样本Ct值=40和无数值时，判断为阴性；检测样本Ct值<37.0时，判断为阳性；若37.0≤检测样本Ct值≤40时，应重复检测，复查结果Ct值<40均可判断为阳性，否则为阴性。

2 结果

2.1 DNA浓度及纯度鉴定 改良法提取的DNA比常规法提取的DNA显著增多(P<0.01，表1)，两者纯度无统计学差异(P>0.05，表1)。

表1 两种方法提取的DNA浓度和纯度比较

注：与常规法比较，①P<0.01

2.2 荧光定量PCR检测结果 常规法组20例脱钙骨组织中，3例结核分枝杆菌阳性，阳性率为15%；而改良法组中检测出11例结核杆菌阳性，阳性率为55%。改良法组结核分枝杆菌检出率明显高于常规组(P<0.01)。同时，常规法组荧光定量PCR检测Ct值均在38左右，处于判读临界值，而改良法组Ct值为34左右，Ct值明显小于常规法组，扩增曲线也明显高于常规法组，提示改良法提取脱钙骨组织中结核杆菌DNA的扩增效率优于常规组(图1)。

3 讨论

1989年，Hance等[7]将PCR技术用于结核分枝杆菌的检测，近年来，越来越多的文献[6,8,9]报道了用荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌。而大部分都是针对石蜡包埋的肺、淋巴结、胸腹膜等骨外组织。但是，结核杆菌可侵犯全身各器官，当累及骨组织时就会发生骨结核病。

骨组织不同于一般的软组织，是一种坚硬的结缔组织，由黏多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的。无机盐以羟基磷灰石结晶的形式存在，其中绝大部分为水合磷酸钙，此外还包括微量碳酸盐和柠檬酸盐等[10-11]。因此，骨组织及钙化病灶经福尔马林固定后，必须先将钙盐除去使组织软化，才能进行后续制片及其他分子检测，常规脱钙液是10%的硝酸。硝酸是临床病理活检中最实用的一种常规脱钙剂，脱钙迅速、完全可靠、作用强、时间短、效果好，但是对骨组织的破坏作用较大[12]，导致DNA的降解。本研究针对脱钙的骨组织，选取适合的DNA提取方法，用荧光定量PCR方法检测结核杆菌。

图1 不同方法提取石蜡包埋脱钙骨组织中DNA经荧光定量PCR检测结核杆菌结果

左：常规法提取石蜡包埋脱钙骨组织中DNA，经荧光定量PCR检测结核杆菌的扩增曲线；右：改良法提取石蜡包埋脱钙骨组织中DNA，经荧光定量PCR检测结核杆菌的扩增曲线

经福尔马林固定石蜡包埋过的组织中，DNA碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联[13]，这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。Warford等[13]也发现，单细胞悬液经30 min福尔马林固定后，DNA产量减少到30%。因此，福尔马林固定会导致DNA的降解。酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变。而骨组织需经福尔马林固定、10%硝酸脱钙12 h以上，因此DNA降解得更多，含量更少。用一般的DNA提取方法得到的DNA质和量无法满足后续实验，从石蜡包埋组织中检测结核杆菌的最小DNA量为20 ng/μl(荧光定量PCR检测结核杆菌试剂盒要求)。

QIAGEN公司的FFPE试剂盒是专门针对石蜡包埋组织，它能打破碱基与组蛋白之间的甲基交联，经蛋白酶K消化，过柱纯化得到DNA(常规法)。但FFPE试剂盒提取穿刺和微小组织或脱钙组织中的DNA效果不佳。本实验采用常规FFPE试剂盒提取的脱钙骨组织DNA浓度非常低，为(6.68±3.72)ng/μl，基本无法到达结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(QIAGEN公司)要求检测的最低DNA浓度(20 ng/μl)。而我们在常规FFPE试剂盒中加入QIAGEN公司微量提取物DNA试剂盒中的carrier RNA(改良法)，结果很大程度地提高了DNA产量，达到(35.32±3.48)ng/μl，二者有统计学差异，而DNA纯度无显著差异。

两法提取的脱钙骨组织DNA经荧光定量PCR检测结核杆菌发现，常规法组检测结核杆菌的阳性率明显低于改良法组。石蜡组织样品PCR扩增成功率低原因之一，就是模板DNA的质和量不够，特别对于硝酸脱钙后的骨组织，DNA遭到严重破坏降解，用常规方法提取出来的质量不达标，会对后续检测造成假阴性结果。改良法引入的而是一种RNA载体，特别是样品中DNA含量极少的情况下，它能增强DNA与QIAamp 离心柱中膜的结合，更大程度上获得全部DNA。但由于额外添加了carrier RNA，因此，最终得到的产物中可能含有添加的carrier RNA，必须按照试剂盒说明按AL缓冲液与carrier RNA比例为200∶1加入。这样即使含有额外加入的carrier RNA，因为RNA容易降解，可以采取晾干时间延长的方法降解而去除掉carrier RNA，得到纯度较高的样品DNA。

结核分枝杆菌起始拷贝数的对数值与每个模板的Ct值呈良好的线性关系[14]，也就是说，起始模板DNA浓度越大，荧光定量PCR扩增的Ct值越小，有效防止脱钙骨组织中结核分枝杆菌荧光定量PCR检测结果为临界值(37≤Ct≤40)，提高检测的敏感性，增加结果的可判读性。本实验结果表明：改良法提取的石蜡包埋脱钙骨组织DNA质量显著提高了5倍，荧光定量PCR检测结核杆菌的阳性率从15%提高到了55%，大大增加了阳性率，提高了敏感性，避免了由于DNA质量过少造成的假阴性结果，对病理诊断提供了辅助作用。

该DNA提取方法的改良和DNA质量的提高，可用于微量石蜡包埋组织的几乎所有基因分析技术，解决了以往由于提取的DNA质量不够而无法进行后续基因分析的问题。改良法适用于穿刺标本和微量石蜡包埋组织DNA提取，比如穿刺小细胞肺癌标本进行EGFR检测，为临床靶向治疗提供依据，可避免再次取材给患者带来的痛苦。同时改良法与常规试剂盒提取法相比，没有增加多余的实验步骤，操作简单，也不浪费实验时间。因此，该方法是一种值得完善和推广的DNA提取方法。

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Comparison of different extraction methods ofMycobacteriumtuberculosisDNA in paraffin-embedded decalcified bone tissues

Pan Xinyan,Wang Li,Yang Changshao,Li Guiyun,Yang Julun,Cai Lin

Departent of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To explore and verify the extraction method ofmycobacteriumtuberculosisDNA in paraffin-embedded and 10% nitric acid decalcified bone tissues.Methods Twenty paraffin-embedded and 10% nitric acid decalcified specimens of necrotic granuloma suspected as bone tuberculosis were chosen as subjects.QIAamp®DNA FFPE Tissue kit was used in the conventional method to extract DNA.While in the modified method,carrier RNA was added into the QIAamp®DNA Micro kit.ThemycobacteriumtuberculosisDNAs of the 20 specimens were extracted by the two methods,respectively.Fluorescence quantitative PCR was used to compare the effects of the two methods on the detection results ofmycobacteriumtuberculosis.Results The amount of DNA extracted by the modified method[(35.32±3.48)ng/μl]was significantly more than that extracted by the conventional method[(6.68±3.72)ng/μl,P<0.05].The positive rate ofmycobacteriumtuberculosisfor DNA detected by the modified method(55%)was significantly higher than that detected by the conventional method(15%,P<0.05).Conclusion The modified extraction ofmycobacteriumtuberculosisDNA from paraffin-embedded decalcified bone tissues is more efficient and simple,which is an ideal method and worthwhile to be promoted in the puncture and little paraffin-embedded tissues.

decalcified bone tissue;mycobacteriumtuberculosisDNA;fluorescence quantitative PCR

650032 昆明，成都军区昆明总医院病理科

蔡 琳，电话：13888596523

R 378.911

A

1004-0188(2014)02-0160-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.016

2013-11-06)