腹腔置管引流对SAP大鼠肾损伤影响的实验研究

周 超，郑晓博，陈光宇，刘 彦，黎鹏武，蒋志伟，汤礼军

腹腔置管引流对SAP大鼠肾损伤影响的实验研究

周 超，郑晓博，陈光宇，刘 彦，黎鹏武，蒋志伟，汤礼军

目的 研究腹腔置管引流对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肾损伤的影响及作用机制。方法 将72只大鼠随机分为3组：SAP组(A组)、SAP引流组(B组)、假手术组(C组)。每组24只，各组分6、12、24 h三个时间点，每时间点分配8只。A组采用开腹后逆行胰胆管注射牛黄胆酸钠造成SAP模型，B组在A组基础上行腹腔置管引流，C组仅行开腹手术。各组分别于处理后6、12、24 h取大鼠血、腹水、胰腺及肾组织，测定血、腹水中淀粉酶和NF-κB水平；胰腺及肾组织HE染色观察病理变化；免疫组化法测肾组织NF-κB的表达水平。结果 A组和B组较C组大鼠血及腹水淀粉酶、NF-κB显著升高，胰腺及肾出现病理变化，肾组织NF-κB表达增多；B组较A组前述变化显著减轻。结论 腹腔置管引流可以减轻大鼠SAP肾损伤。

大鼠；重症急性胰腺炎；腹腔引流；肾损伤；NF-κB

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是常见急腹症之一，其病情发展极快且凶险，多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)和全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是其常见的并发症。肾功能损害的发病率为14%～43%，一旦发展至急性肾功能衰竭(acute renal failure，ARF)，其病死率可达80%[1]，SAP的严重程度和肾损害的程度呈正相关[2]。SAP时腹腔渗出液含有大量炎性因子、毒素、活化酶等，这些有毒物质进入血循环，对全身脏器有很大毒性。近年来成都军区总医院全军普通外科中心采取以腹腔置管引流为主的多种微创方法治疗SAP取得了良好疗效，避免了传统开腹手术胰腺坏死组织清除及腹腔积液引流的复杂手术治疗，减轻了患者痛苦[3]。但是腹腔置管引流治疗改善SAP患者病情的具体机制尚不清楚。本实验拟通过观察腹腔置管引流治疗大鼠SAP肾损伤的变化情况，探讨该方法治疗SAP肾损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 选用健康SPF级雄性Wistar大鼠72只[购自四川省资阳市达硕动物公司，生产许可证号：SCXK(川2008-24)]，体重200～250 g，适应性喂养1 w；牛黄胆酸钠(购自Sigma公司)；血清、腹水淀粉酶试剂盒(购自泛博生物公司)；NF-κB的ELISA试剂盒(购自BD公司)；NF-κB抗体(购自博士德公司)。

1.2 动物分组与模型制备 将72只大鼠随机分为3组，每组24只，实验前12 h及术后禁食不禁水。(1)A组：参照Aho法[4]，腹腔注射3%戊巴比妥拉钠0.1 ml/100 g体重麻醉，开腹后动脉夹夹闭肝门部胆管，经十二指肠乳头逆行胰胆管穿刺，用输液泵以3 ml/h的速度注射5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)，注射完毕后用动脉夹夹闭近十二指肠端的胰胆管10 min。肉眼见胰腺组织充血、水肿、出血、坏死等改变后，表明制备大鼠SAP动物模型成功，关腹对照观察。(2)B组：按A组方法SAP模型制备成功后，在大鼠下腹部置入引流管，分层关腹后在引流管尾端接上引流袋。(3)C组：仅进行开腹手术，翻动胰腺后关腹。所有大鼠均于术后背部皮下按40 ml/kg体重注射37 ℃生理盐水，间隔12 h注射1次，连续注射2次。

1.3 标本取材和处理 每组大鼠24只，再分为3组各8只，分别于相应处理后的第6、12、24 h腹主动脉采血，3000 r/min离心，取上清液置于-20 ℃冻存，以待检测；收集引流组引流袋内腹水，3000 r/min离心10 min后于-80 ℃保存；处死大鼠后取胰腺及肾组织作病理切片，观察病理变化。将一部分肾组织置于10%中性甲醛缓冲液中固定，一部分-80 ℃保存。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 血清和腹水淀粉酶(AMY)和NF-κB检测 采用Beckman-Coulter Synchron LX-20全自动生化分析仪检测血清和腹水AMY水平；采用BIO-TEK 1510-00275C全自动酶标仪检测血清和腹水NF-κB浓度，按NF-κB试剂盒说明书步骤操作。

1.4.2 肾组织NF-κB免疫组化染色 取肾脏10%中性福尔马林固定，脱水、包埋，5 μm连续切片。切片经常规脱蜡至水，胃蛋白酶消化后滴加相应的一抗(小鼠抗大鼠NF-κB)，4 ℃冰箱过夜，滴加HRP标记的相应二抗(羊抗小鼠IgG抗体)，室温2 h，DAB显色10 min，中性树胶封片。NF-κB阳性细胞为胞浆与胞核内出现棕黄色或深黄色颗粒。采用Image-Pro Plus图像分析系统对免疫组化染色切片中NF-κB表达的阳性细胞灰度值进行测定。

2 结果

2.1 一般情况 A组大鼠造模成功后，活动减少，精神萎靡，食欲下降，尿量减少，且随时间延长，上述症状逐渐加重。B组较A组大鼠活动增加，精神可，食欲增加，尿量增多，且随腹水不断引流，症状逐渐改善。

2.2 血清及腹水淀粉酶活性 A组和B组造模后各时间点血清淀粉酶活性较C组显著升高(P<0.05)；B组与A组比较，各时间点血清及腹水淀粉酶活性显著下降(P<0.05)。且随时间的延长逐渐达到稳态。见表1。

2.3 胰腺及肾病理变化。

2.3.1 胰腺病理变化 A组在造模后24 h，胰腺水肿伴充血出血，胰腺实质大片凝固性坏死，间质炎性细胞浸润；B组在造模后24 h，胰腺充血水肿程度较轻，局部胰腺点状坏死，少量间质炎性细胞浸润；C组无病理改变。见图1。

2.3.2 肾病理变化 A组在造模后24 h肾小球瘀血，间质水肿充血增宽，大量炎性细胞浸润，肾小管管腔扩大，管壁细胞呈扁平状，刷状缘损伤、脱落，细胞浆空泡形成，肾小管上皮细胞可见广泛坏死，管腔内可见大量红细胞及其他管型。B组在治疗后24 h肾小管上皮细胞水肿，间质水肿，肾小管偶见上皮细胞坏死，刷状缘损伤、细胞浆空泡形成、肾小管腔可见管型、间质炎性细胞浸润较A组减轻；C组无病理改变。见图2。

2.4 血清及腹水NF-κB浓度结果 A组和B组造模后各时间点血清NF-κB浓度较C组显著升高(P<0.05)；B组与A组比较，各时间点血清及腹水NF-κB浓度显著下降(P<0.05)。且随时间的延长逐渐达到稳态。见表2。

2.5 观察及分析肾组织NF-κB免疫组化结果 显微镜下可见：C组大鼠肾组织中NF-κB(棕褐色物质)分布稀疏、零星存在；A组大鼠中棕褐色物质较C组多、呈密集分布；而B组棕褐色物质较A组少、呈散在分布(图3)。灰度值测定结果显示：与C组比较,A组和B组NF-κB染色平均灰度值明显升高(P<0.05)；B组与A组比较,灰度值明显降低(P<0.05)。

表1 两组术后不同时间血清及腹水淀粉酶活性比较(U/L，n=8)

注：与同时间C组比较，①P<0.05；与同时间A组比较，②P<0.05

图1 造模后24 h各组大鼠胰腺组织病理变化(HE ×200)

图2 造模后24 h各组大鼠肾组织病理变化(HE ×200)

时间(h)血清NF-κBA组 B组 C组 腹水NF-κBA组B组678.175±7.344①47.500±8.069①②28.500±3.70278.675±7.21630.700±6.696②1284.300±10.365①57.050±5.325①②31.863±3.25885.363±7.89831.840±4.645②24101.462±7.952①50.138±8.221①②29.212±5.12184.363±11.02231.025±6.816②

注：与同时间C组比较，①P<0.05；与同时间A组比较，②P<0.05

图3 造模后24 h各组大鼠肾组织NF-κB免疫组化结果(HE ×200)

3 讨论

有资料表明，SAP时产生大量的胰腺炎相关性腹水(pancreatitis associated ascitic fluid，PAAF)，其中的弹性蛋白酶和多种毒性细胞因子和介质可经腹膜吸收入血，通过不同的分子机制导致SAP时肾功能的损害[5]。SAP产生的大量PAAF内含有多种毒性和有害物质，如内毒素、淀粉酶、脂肪酶、弹性蛋白酶、磷脂酶A、丙二醛、游离脂肪酸以及肿瘤坏死因子、白细胞介素等炎性细胞因子和介质，它们对SAP的病情发展有着不可低估的影响。国外研究发现，早期激活的NF-κB可能是各种炎症介质产生的“闸门”，通过“扳机样”作用触发炎症介质的级联反应，造成SAP的炎症蔓延、恶化[6]。研究发现，炎症介质的过度激活是SAP发生肾衰竭的重要因素，控制SAP炎症程度，有利于减轻肾损伤[7]。

本研究发现，A组与B组造模后6 h淀粉酶开始升高，并开始出现腹水，腹水和血清中NF-κB浓度也开始增高。而腹腔置管引流组通过将腹水引流出体外，腹水中淀粉酶、NF-κB的浓度显著下降，血清中NF-κB的浓度随之下降。鲍世韵等[8]研究发现，通过腹腔镜下腹腔置管引流治疗猪SAP，引流组血浆NF-κB含量较对照组显著下降，表明腹腔镜下腹腔置管引流能够有效减轻SAP猪过度的炎症反应。本实验结果与其相似，说明通过腹腔置管引流治疗，可以有效引流出腹水中大量的炎症因子及各种有毒物质，减少各种有毒物质吸收入血。A组与B组较C组各时相点肾NF-κB免疫组化表达升高，肾组织病理变化明显加重；B组较A组各时相点肾NF-κB免疫组化表达明显减少，肾组织病理变化减轻，但与C组仍有差距。说明炎症因子参与了肾损伤，通过腹腔引流将腹水NF-κB引流出体外，减少了炎症因子吸收入血，减轻了全身炎症反应程度[9]。全身的炎症程度减轻，炎症因子对肾组织损害减少，减轻了肾的损伤。

腹腔置管引流治疗减轻了肾损伤，有利于防止肾功能衰竭，分析其作用机制可能是：腹腔置管引流能及时将含有大量高活性消化酶类、内毒素以及炎症介质的血性腹腔积液迅速排出体外，减少了腹腔积液中大量有毒物质的吸收。尤其是各种炎症因子的释放减少，阻断了SAP发生发展的关键环节，同时也有利于防止内毒素刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞产生细胞因子而引起的全身炎症反应综合征，减轻了肾损伤，从而有利于改善SAP病情。

[1] Lin HY,Lai JI,Lai YC.Acute renal failure in severe pancreatitis:a population-based study[J].Upsala Journal of Medical Sciences,2011,116(2):155-159.

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[9] 方驰华,郝建志,范应方.围胰腺区域性微创治疗大鼠重症急性胰腺炎的实验研究[J].中国医学创新,2011,8(10):12-15.

Experimental study on effects of intraperitoneal catheter drainage on renal injury of rats with severe acute pancreatitis

Zhou Chao1,2,Zheng Xiaobo1,Chen Guangyu1,Liu Yan3,Li Pengwu1,Jiang Zhiwei1,Tang Lijun1

1.Center for General Surgery,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,the Sixth People's Hospital of Chengdu City,Chengdu,Sichuan,610051,China;3.Department of Senile Diseases,the Fifth People's Hospital of Chengdu City,Chengdu,Sichuan,611130,China

Objective To investigate the effects of intraperitoneal catheter drainage on the renal injury of rats with severe acute pancreatitis(SAP)and its mechanism.Methods Seventy two rats were randomly divided into SAP group(group A),SAP drainage group(group B),and the sham operation group(group C)with 24 ones in each group.There were examinational time points,i.e.6,12,and 24 h,and each time point was allocated with 8 rats.In group A,SAP model was established through retrograde cholangiopancreatography injection with sodium taurocholate.Group B

intraperitoneal catheter drainage based on the same treatment as group A.Group C received only the laparotomy.The rats' blood,ascites,pancreatic gland,and nephridial tissue samples were obtained 6,12,and 24 h after the treatment in order to detect the level of amylase and NF-κB in blood and ascites.HE staining was carried out for pancreatic and nephridial tissues in order to observe the pathological changes.Immunohistochemical method was used to detect the expression level of NF-κB in nephridial tissues.Results Compared with the levels of group C,the levels of amylase and NF-κB in blood and ascites of group A and B increased significantly,and pathological changes occurred in pancreatic and renal tissues.The expression of NF-κB increased in renal tissues.The preoperative pathological changes in group B significantly decreased compared with those in group A.Conclusion Intraperitoneal catheter drainage can relieve the kidney injury in rats with severe acute pancreatitis.

rat;severe acute pancreatitis;intraperitoneal catheter drainage;kidney injury;NF-κB

四川省青年科技创新研究团队基金资助课题，四川省2011年第五批科技计划项目(2011JTD0010)

610083 成都，成都军区总医院全军普通外科中心(周 超，郑晓博，陈光宇，黎鹏武，蒋志伟，汤礼军)；成都市第六人民医院肝胆外科(周 超)；成都市第五人民医院老年病科(刘 彦)

汤礼军，E-mail:whjtlj@yahoo.com.cn

R 691.6/692

A

1004-0188(2014)02-0129-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.005

2013-03-02)