高湿环境致大鼠肾功能损害与水通道蛋白-2的表达

杨 芸，李 昆，李 薇，郭 鑫，王 超，宋富强，周龙甫，呼永河

高湿环境致大鼠肾功能损害与水通道蛋白-2的表达

杨 芸，李 昆，李 薇，郭 鑫，王 超，宋富强，周龙甫，呼永河

目的 观察高湿环境对SD大鼠肾功能的影响，探讨水通道蛋白-2(AQP2)和加压素受体-2(V2R)在高湿环境大鼠肾脏中的表达及其意义。方法 20只SD大鼠随机分为对照组和高湿组，每组10只。高湿组大鼠每日放入人工气候箱10 h[温度25 ℃，相对湿度(RH)为(90±2)%]，对照组置常温常湿环境[温度(25±2)℃，RH(55±5)%]。处理20 d后，荧光定量PCR检测肾髓质AQP2和V2R mRNA表达水平，Western blot法检测肾髓质AQP2、磷酸化AQP2(p-AQP2)以及V2R的蛋白表达水平。结果 与对照组相比，高湿组大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)显著升高(P<0.05)；肾髓质AQP2和V2R mRNA表达较对照组显著降低(P<0.01)，AQP2、V2R的蛋白表达水平和AQP2的磷酸化水平较对照组显著降低(P<0.05)。结论 高湿环境可对大鼠肾功能造成一定损害,且使V2R和AQP2的表达水平降低，AQP2磷酸化水平也降低，提示V2R和AQP2可能参与了高湿环境引起的肾功能损害的发生发展。

高湿环境；肾功能；水通道蛋白-2；加压素受体-2；磷酸化

环境因素如温度、湿度等对机体有重要影响[1]，高湿环境与高寒、高热环境一样，可对机体造成损伤，是诱使疾病发作的重要因素之一。研究表明，肾功能受损可能与肾髓质AQP2的表达相关[2]。水通道蛋白-2(AQP2)是加压素(vasopresin，VP)依赖性水通道蛋白，在肾调节机体水平衡时发挥重要作用。加压素受体-2(V2R)分布于肾脏集合管主细胞的基底侧膜，通过激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)使AQP2磷酸化并重新分布，从而调节集合管对水的通透性。本研究通过观察高湿环境对大鼠肾功能、肾髓质AQP2和VP通路受体V2R表达的影响，探讨高湿环境致肾功能损害的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备 Western blot一抗兔抗大属多克隆AQP2抗体购自ImmunoWay(YT0290)公司，p-AQP2与V2R兔抗大鼠多克隆抗体购自北京博奥森抗体公司(bs-12507R/bs-1705R)，GAPDH抗体购于上海康成生物公司(KC-5G5)，二抗羊抗兔(A0208)购自碧云天生物技术研究所；TRIzol(R0016)购自碧云天生物技术研究所； 一步法实时荧光定量RT-PCR试剂盒(RR086A)购自TAKARA公司， CFX96 PCR仪(BIO-RAD)；人工气候箱(RXZ-1000A，宁波江南仪器厂)。

1.2 动物模型 20只SPF级雄性SD大鼠，健康状况良好，平均体重200～220 g，由四川省医学科学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK(川)2004]，按随机数字表法分为正常组10只，环境实验条件：温度(25±2) ℃，相对湿度RH为(50±5)%；高湿组10只：采用人工气候箱模拟高湿环境，设置条件：温度25 ℃，RH为(90±2)%，10 h/d，共20 d。

1.3 肾功能检测及肾脏取材 用加入EDTA的抗凝管采集每只活体大鼠的腹主动脉血液，离心收集血清后，BECKMAN COULTER AU5800全自动生化仪检测肾功能指标(BUN、SCr)；分别取两组大鼠的肾脏，轻轻剥离肾表面膜，分离左肾髓质，于液氮中速冻后存于-80 ℃冰箱，以备后续做AQP2及V2R分子检测。

1.4 AQP2和V2R的mRNA表达水平检测 按照TRIzol试剂说明书提取总RNA，取40 ng RNA做实时荧光定量PCR扩增检测，步骤及转录条件严格按试剂盒说明书进行，肌动蛋白β-actin为内参。引物序列如下:AQP2上游引物：TTGCAGGAACCAGACACTTG，下游引物:GCGGAGACGAGCACTTTTAC；V2R上游引物:TGTGGCTCTGTTTCAAGTGC，下游引物:GCCAGGATCATGTAGGAGGA；β-actin 上游引物:ACGGTCAGGTCATCACTATCG，下游引物:GGCATAGAGGTCTTTACGGATG。

1.5 AQP2、p-AQP2和V2R的蛋白表达测定 常规提取左肾髓质总蛋白，BCA法定量，以每孔50 μg上样量为标准，进行SDS-PAGE蛋白电泳，甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH为内参。其后转移至PVDF膜，用5%的BSA封闭膜，进行免疫结合，之后采用ECL发光法在暗室内胶片曝光成像。使用Image plus 5.0检测条带灰度值，并分别与相应GAPDH灰度值相比，灰度值之比作为检测样本的蛋白相对含量。

2 结果

2.1 高湿环境对大鼠肾功能的影响 高湿环境下，大鼠肾功能两项指标BUN、SCr相比正常组明显升高(P<0.05，表1)。

表1 两组BUN、SCr及AQP2和V2R的mRNA水平的比较(n=10)

注：与正常组比较，①P<0.05，②P<0.01

2.2 高湿环境对肾髓质AQP2和V2R的mRNA水平的表达影响 与对照组相比，高湿组AQP2和V2R的mRNA表达水平均显著降低(P<0.01，表1)。

2.3 高湿环境对AQP2、p-AQP2和V2R蛋白表达水平的影响 高湿组AQP2和V2R较对照组的蛋白表达均降低(P<0.05或P<0.01，图1)，且p-AQP2较对照组表达降低尤为显著。分析结果显示，高湿组AQP2蛋白表达较对照组降低39.02%，而p-AQP2较对照组表达降低68.75%(表2)。

图1 大鼠肾髓质AQP2、p-AQP2和V2R的半定量分析AQP2分子量26 kDa，p-AQP2 分子量29 kDa，V2R 分子量40 kDa，GAPDH 分子量36 kDa

表2 两组AQP2、P-AQP2、V2R的光密度倍比值比较

注：与正常组比较，①P<0.05，②P<0.01

3 讨论

高湿环境下动物的肾脏、肺和皮肤等都会出现不同程度损伤[3]，但其机制尚未明了。本研究通过对高湿环境下大鼠肾功能的检测，发现BUN、SCr两项指标显著升高，提示高湿环境大鼠的肾功能受到损害。

已有研究发现，AQP2的表达变化与肾功能明显相关[4]，而其表达的调节依赖于适度的VP分泌水平，VP通过与V2R的结合，一方面促进AQP2插入到顶部质膜区域，另一方面通过增强AQP2的磷酸化作用，促使肾集合管对水的通透性增强[5-7]。肾集合管内皮细胞在接收VP刺激信号前，AQP2一直处于细胞表面称作“入胞-抵抗”的膜区域的动态平衡中，VP分泌的改变使AQP2在“入胞-抵抗”的平衡区域发生运动，同时其磷酸化的水平也相应变化[8]。李红芬等[9]认为，p-AQP2表达与髓质纤维化、炎细胞浸润程度呈负相关，提示大鼠肾脏p-AQP2的表达降低可能诱导髓质纤维化，炎细胞浸润程度升高，致使肾功能受损。Di等[10]发现，AQP2与肾脏集合管水平衡控制、细胞迁移分化等进程紧密相关，AQP2表达降低可诱使肾髓质细胞迁移分化进程异常，导致肾功能程度性受损。高湿环境下，肾功能两项指标出现增高，AQP2和V2R在mRNA和蛋白水平都相应降低，且AQP2的磷酸化水平相比总蛋白降低更为显著，提示高湿环境肾功能受损。从AQP2和V2R的表达降低，可推断整个机体通过肾脏呈现出对水转运的抑制状态；磷酸化AQP2的水平降低，说明分布于肾集合管顶部质膜的活性AQP2分子十分有限。以上结果都提示，高湿环境下肾脏对水的重吸收功能出现障碍，这种障碍的产生与AQP2的表达和磷酸化水平有着重要联系。有研究报道，AQP2的表达改变先于SCr和BUN的变化，可作为肾功能损害的早期观测指标[11-12]。据此推测，高湿环境对肾功能损害发生在V2R和AQP2改变之后，AQP2可以作为高湿环境对肾损伤的重要检测指标。

总之，通过对高湿环境下大鼠肾功能、AQP2和V2R三者的监测，加深了对高湿环境肾功能损伤的认识，推测其影响机制是通过V2R-AQP2这一通路来实现的。本实验结果支持这样的推论，在高湿环境下，大鼠肾功能一定程度受损，V2R和AQP2的表达水平降低，AQP2的磷酸化水平也降低。但是，高湿环境是如何影响机体激素的变化，机体VP的水平到底随高湿如何改变，是否存在其他通路导致损伤的发生，目前这些都不太清楚，需进一步研究。

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Influence of high humidity environment on rats' renal function lesion and the expression of aquaporin protein-2

Yang Yun1,Li Kun1,Li Wei1,Guo Xin1,Wang Chao2,Song Fuqiang1,Zhou Longfu3,Hu Yonghe1

1.Central Laboratory;2.Department of Laboratory;3.Department of Medical Engineering,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To observe the influence of high humid environment on SD rats' renal function,and to discuss the expression and significance of aquaporin protein-2(AQP2)and vasopressin receptor-2(V2R)in rats' kidneys in high humidity environment.Methods Twenty SD rats were randomly divided into control and high humidity groups with 10 ones in each group.The rats in the high humidity group were carried daily into artificial climatic cabinet for 10 hours[the temperature was 25 ℃,and the relative humidity was(90±2)%].The rats in the control group were put in the environment with common temperature[the temperature was(25±2)℃,and the RH was (55±5)%].After 20 d,fluorescent quantitation PCR was used to detect the mRNA expression levels of renal medull AQP2 and V2,and Western blotting method was used to detect the protein expression levels of AQP2,phosphorylated AQP2(phosphorylation of aquaporin protein-2,p-AQP2),and V2R.Results Compared with control group,the blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)in the high humidity group significantly increased compared with those indexes in the control group(P<0.05).The mRNA expression levels of renal medulla AQP2 and V2R and the protein expression levels of AQP2,p-AQP2,and V2R in the high humidity group all significantly decreased compared with those levels in the control group [(P<0.01)and(P<0.05)].Conclusion High humidity environment can cause damage of the renal function of the rats and decrease the expression levels of V2R and AQP2 and the phosphorylation level of AQP2,which indicates that V2R and AQP2 may be involved in the development of renal function lesion caused by the humid environment.

high humidity environment;renal function;aquaporin protein-2;vasopressin receptor-2;phosphorylation

全军医学科技“十二五”重点项目(BWS11J067)

610083 成都,成都军区总医院中心实验室(杨 芸，李 昆，李 薇，郭 鑫，宋富强)，检验科(王 超)，医学工程科(周龙甫)；成都军区总医院(呼永河)

呼永河,E-mail:huyonghe@mvip.126.com

R 692

A

1004-0188(2014)02-0123-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.003

2013-12-25)