小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中SRC-3的作用研究

李 军，白树荣，林 露，安 虹，孙阳阳，易晓波，刘英海，王军平，粟永萍

小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中SRC-3的作用研究

李 军，白树荣，林 露，安 虹，孙阳阳，易晓波，刘英海，王军平，粟永萍

目的 探讨类固醇受体辅活化子(SRC)-3蛋白在脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中的作用。方法 健康SPF级雌性野生型(SRC-3+/+)小鼠、SRC-3基因敲除(SRC-3-/-)小鼠各5只，分别分离和原代培养腹腔巨噬细胞，并相应分为SRC-3+/+组和SRC-3-/-组。收集并调整细胞浓度为1×106/ml，接种于6孔板，1 ml/孔，给予10 μg/ml LPS刺激，分别在刺激前(0 h)、刺激后4 h和12 h收集腹腔巨噬细胞。通过Western blot测定腹腔巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)的表达，并通过transwell趋化实验和中性红吞噬实验，分别测定腹腔巨噬细胞的趋化指数(CI)和吞噬功能。结果 LPS诱导前两组腹腔巨噬细胞TLR4的蛋白表达和CI差别无统计学意义，但SRC-3-/-组的吞噬功能显著低于SRC-3+/+组(P<0.01)；无论是SRC-3+/+组，还是SRC-3-/-组，LPS诱导4 h和12 h后，两组腹腔巨噬细胞TLR4的表达和CI均显著增高(P<0.01)，但在相应时间点，SRC-3-/-组与SRC-3+/+组相比差别无统计学意义。LPS刺激4 h后，两组吞噬功能均显著增加(P<0.01)，但SRC-3-/-组增加的程度显著低于SRC-3+/+组(P<0.01)；相反，LPS刺激12 h后，两组吞噬功能均受到不同程度的抑制(P<0.05或P<0.01)，且SRC-3-/-组较SRC-3+/+组抑制的程度更低(P<0.01)。结论 SRC-3调节腹腔巨噬细胞的先天性免疫功能可能与吞噬功能有关，而与其趋化功能无关。

腹腔巨噬细胞；类固醇受体辅活化子-3；Toll样受体4；趋化；吞噬

巨噬细胞在天然免疫反应中起重要作用，受到脂多糖(LPS)、病原体等刺激可以迅速被激活，一方面产生大量细胞因子，引起全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的发生发展，另一方面可通过趋化功能迁移到感染或受损部位，吞噬异物、清除自身衰老和凋亡细胞，从而发挥重要的细胞免疫作用。类固醇受体辅活化子(steroid receptor coactivator，SRC)家族是核受体和一些转录因子的辅活化子。前期通过细菌负荷实验，我们证实SRC-3在维持机体正常的天然免疫方面具有重要作用，其蛋白缺失可降低机体清除和降解细菌及产物的能力[1]，并抑制LPS诱导的炎性细胞因子的分泌和释放，精细地调节腹腔巨噬细胞的炎症反应功能[2-3]。为了进一步阐明SRC-3在巨噬细胞免疫反应中的作用，本研究利用SRC-3基因敲除(SRC-3-/-)小鼠，探讨SRC-3蛋白缺失对腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能的影响。

1 资料与方法

1.1 主要仪器 细胞培养超净工作台；CO2细胞培养箱；Heraeus台式低温高速离心机；Transwell 24孔培养板；Olympus倒置显微镜；Beckman DU640分光光度仪；Biorad半干转印电泳仪；Biorad Gel Doc2000凝胶成像分析系统。

1.2 试剂 LPS(Sigma)；RPMI 1640培养基(Gibco)、胎牛血清、Hank液(Hyclone)、M-PerTMMammalian Protein Extraction Reagent(Pierce)；兔抗Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)多克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、浓缩型DAB试剂盒(中杉)；鼠源单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(peprotech)。

1.3 方法

1.3.1 腹腔巨噬细胞分离培养 健康清洁SRC-3+/+小鼠、SRC-3-/-雌性小鼠(提取尾尖DNA，通过PCR方法鉴定[4])各5只(从美国休斯顿贝勒医学院引进)，3月龄，参照文献[2]方法分离腹腔巨噬细胞并接种于6孔板，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中原代培养24 h待用。

1.3.2 腹腔巨噬细胞分组及处理 将原代培养腹腔巨噬细胞分为SRC-3+/+组和SRC-3-/-组，每只分别收集并计数，调整细胞浓度为1×106/ml，接种于6孔板，1 ml/孔，无血清培养2 h后，每孔加入10 μg/ml LPS刺激。分别在LPS刺激前(0 h)、LPS刺激后4 h、12 h收集腹腔巨噬细胞。

1.3.3 Western blot检测腹腔巨噬细胞TLR4表达水平 取收集的腹腔巨噬细胞，按M-PerTMMammalian Protein Extraction Reagent操作说明提取总蛋白。Bradford法测定蛋白浓度，取40 μg蛋白行SDS-PAGE，并半干转印至PVDF膜。PVDF膜在封闭液(0.5% BSA、0.01 mol/L PBS)内4 ℃过夜。分别加入TLR4多克隆抗体(1∶300)、GAPDH多克隆抗体(1∶800)，37 ℃孵育2 h，PBST洗膜5 min×3，再相应加入辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶400)，37 ℃孵育1 h，PBST洗膜5 min×3，最后DAB试剂盒显色。通过凝胶成像分析系统分析各条带OD值×面积(Int×mm2)，以TLR4与GAPDH的比值表示TLR4的相对表达量。

1.3.4 腹腔巨噬细胞趋化功能检测 参照改良Boyden chamber法[5]，向transwell趋化小室上室每孔加人100 μl细胞密度为1×106/ml的腹腔巨噬细胞悬液，下室加入RPMI 1640培养基580 μl和20 μl MCP-1，置5% CO2、37 ℃培养2 h，取出小室，吸弃上室内细胞悬液，并擦净上室膜上未迁移细胞，37 ℃预热PBS清洗小室3次。显微镜下计数小室下表面的巨噬细胞数，每个小室随机取5个视野，趋化结果以高倍视野下(×400)的趋化指数(chemotactic index，CI)表示，代表下室面每个高倍视野的平均细胞数[6]。

1.3.5 腹腔巨噬细胞吞噬功能测定 参照文献[7]，用培养液调整LPS刺激前后的腹腔巨噬细胞至3×106/ml，0.1 ml/孔，孵育2 h，弃上清，每孔加0.72 g/L中性红溶液100 μl，继续孵育30 min，弃中性红，0.01 M PBS洗4次，加入细胞裂解液200 μl，37 ℃过夜，检测A540值，通过A540值大小来反映腹腔巨噬细胞吞噬能力的强弱。

2 结果

2.1 LPS诱导腹腔巨噬细胞TLR4的表达 正常情况下，两组腹腔巨噬细胞TLR4的蛋白表达差别无统计学意义(P>0.05)；无论是SRC-3+/+组还是SRC-3-/-组，LPS诱导4 h和12 h后，两组腹腔巨噬细胞TLR4的表达均显著增高(P<0.01)，但在相应时间点，SRC-3-/-组和SRC-3+/+组相比差别无统计学意义(图1)。

图1 腹腔巨噬细胞TLR4 Western blot检测结果

1～3：分别表示SRC-3+/+组12 h、4 h、0 h；4～6：分别表示SRC-3-/-组0 h、4 h、12 h

2.2 腹腔巨噬细胞的趋化功能变化 正常情况下，SRC-3+/+组和SRC-3-/-组腹腔巨噬细胞的趋化指数的差别没有统计学意义；LPS诱导4 h后，两组腹腔巨噬细胞的趋化指数均显著升高(P<0.01)，12 h后均有所下降，但仍显著高于LPS诱导前(P<0.01)；在相应时间点，SRC-3-/-组和SRC-3+/+组相比差别无统计学意义。见图2。

图2 腹腔巨噬细胞的趋化指数

2.3 腹腔巨噬细胞的吞噬功能变化 LPS诱导前，SRC-3-/-组腹腔巨噬细胞的吞噬功能显著低于SRC-3+/+组(P<0.01)；LPS刺激早期(4 h)，两组腹腔巨噬细胞吞噬功能均显著增加(P<0.01)，但SRC-3-/-组增加的程度显著低于SRC-3+/+组(P<0.01)；LPS刺激12 h后，无论是SRC-3+/+组还是SRC-3-/-组，腹腔巨噬细胞的吞噬功能均受到不同程度的抑制(P<0.05或P<0.01)，且SRC-3-/-组较SRC-3+/+组抑制的程度更低(P<0.01)。见表1。

表1 LPS诱导不同时间后腹腔巨噬细胞吞噬功能的变化(A540值，n=5)

注：与本组0 h相比，①P<0.05，②P<0.01；与同时间SRC-3+/+组相比，③P<0.01

3 讨论

巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞，既有吞噬异物的非特异性免疫功能，也可通过处理和递呈抗原参与特异性免疫反应，在天然免疫和获得性免疫反应的始动中具有关键性作用。探讨SRC-3蛋白在腹腔巨噬细胞趋化和吞噬功能中的作用，阐明巨噬细胞活化及随后免疫抑制的机理，对于严重创伤或感染的救治具有重要的临床意义。

体内腹腔巨噬细胞一般都处于静止状态，受到刺激后可以迅速被激活，产生大量的细胞因子，从而导致SIRS的发生发展。LPS是腹腔巨噬细胞激活的重要诱导剂， TLR4是介导LPS信号跨膜转导的主要受体，LPS/TLR4/NF-κB信号通路是重要炎症通路之一[8]。本研究发现，LPS诱导4 h和12 h后，SRC-3+/+和SRC-3-/-腹腔巨噬细胞TLR4的蛋白表达均显著增高，但正常情况和LPS刺激下表达无显著差别，表明SRC-3可能并不参与TLR4的蛋白表达，其与腹腔巨噬细胞的活化无关。前期研究发现，SRC-3缺失可减轻LPS诱导的炎症反应[3]，提示SRC-3调控LPS/TLR4/NF-κB信号通路，可能不在TLR4环节，而可能在NF-κB水平[9]。

巨噬细胞迁移到感染或受损部位是细胞介导免疫反应的一个重要部分，巨噬细胞的趋化功能反映了其迁移能力，是影响巨噬细胞在生理和病理情况下发挥功能的重要因素，对于细胞趋化功能的检测，其中最常用的方法是改良Boyden chamber法[10]。本研究发现，SRC-3+/+和SRC-3-/-腹腔巨噬细胞的趋化功能在正常情况下没有差别，LPS刺激4 h后显著升高，12 h后逐渐恢复，SRC-3-/-和SRC-3+/+腹腔巨噬细胞相比无显著差别，表明SRC-3蛋白与腹腔巨噬细胞的趋化功能无关，其蛋白缺失并不影响腹腔巨噬细胞的趋化能力。

吞噬杀菌活性是腹腔巨噬细胞最基木的功能，通过吞噬异物、清除自身衰老和凋亡细胞发挥重要的细胞免疫作用，对机体自身稳态的平衡有着重要意义。采用中性红吞噬实验检测腹腔巨噬细胞的吞噬功能，结果发现正常情况下SRC-3-/-腹腔巨噬细胞的吞噬功能显著低于SRC-3+/+细胞；LPS刺激早期(4 h)，两种腹腔巨噬细胞吞噬功能均显著增加，但SRC-3-/-细胞增加的程度显著低于SRC-3+/+细胞；LPS刺激12 h后，腹腔巨噬细胞的吞噬功能受到显著抑制，但SRC-3-/-细胞较SRC-3+/+细胞抑制的程度更低，表明SRC-3蛋白与腹腔巨噬细胞的吞噬功能有关，这可能正是其蛋白缺失降低机体清除细菌能力的缘故[1，11]。SRC-3蛋白参与腹腔巨噬细胞的吞噬功能，是否还参与细菌及产物的处理与降解，目前还不清楚，这需要进一步的实验以证实。

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Study on the role of steroid receptor coactivator-3 in chemotactic and phagocytic function of mouse peritoneal macrophages

Li Jun1,Bai Shurong1,Lin Lu1,An Hong1,Sun Yangyang1,Yi Xiaobo1,Liu Yinghai1,Wang Junping2,Su Yongping2

1.Department of Anesthesiology,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Combined Injury Institute of PLA/National Key Laboratory of Trauma,Burn,and Combined Injury,the Third Military Medical University,Chongqing,400038,China

Objective To investigate the effects of steroid receptor coactivator(SRC)-3 on the chemotactic and phagocytic function of lipopolysaccharide(LPS)induced mouse peritoneal macrophages(PMФ).Methods Healthy SPF-grade wild female type(SRC-3+/+)mice and SRC-3 gene knock-out(SRC-3-/-)mice were used in this study.Their PMФ were isolated and primary cultured,respectively.After the collection,the concentration of PMФ was adjusted to 1×106/ml.PMФ were cultured in 6 orifice plates with 1 ml/orifice and stimulated by 10 μg/ml LPS.Peritoneal macrophages were collected before the stimulation,4 h,and 12 h after the stimulation.The expressions of Toll-like receptor 4(TLR4)were determined by Western blot assay.The chemotactic index(CI)and phagocytic function of PMФ were examined through the Transwell chemotaxis assay and the phagocytosis of neutral red assay.Results Before LPS induction,there was no significant difference in the protein expression of TLR4 and CI between the two groups,but the phagocytic function in SRC-3-/-group was significantly poorer than that in SRC-3+/+group(P<0.01).The TLR4 expression level and the CI of PMФ in both groups significantly increased 4 and 12 h after the LPS induction(P<0.01),but there was no significant difference between the two groups at the corresponding time points.The phagocytic function of PMФ in both groups increased 4 h after the induction,but the increasing degree in the SRC-3-/-group was significantly lower than that in SRC-3+/+group(P<0.01).On the contrary,the phagocytic function in two groups were both inhibited at different degrees(P<0.05 orP<0.01)12 h after the LPS induction,but the inhibition degree in SRC-3-/-group was lower than that in SRC-3+/+group(P<0.01).Conclusion The innate immunity function of SRC-3 which regulates the peritoneal macrophages may be correlated with the phagocytic function but has no correlation with its chemotactic function.

peritoneal macrophages;steroid receptor coactivator-3;Toll-like receptor 4;chemotaxis;phagocytosis

成都军区总医院院管课题(2011YG-B09)；研究型人才基金和创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室开放基金(SKLKF200910)

610083 成都，成都军区总医院麻醉科(李 军，白树荣，林 露，安 虹，孙阳阳，易晓波，刘英海)；第三军医大学解放军复合伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室(王军平，粟永萍)

粟永萍，E-mail：yongpingsutmmu@yahoo.cn

R 446.63

A

1004-0188(2014)02-0125-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.004

2013-10-31)