HPLC法进行芩霍双清饮中黄芩苷的含量测定

王璐

HPLC法进行芩霍双清饮中黄芩苷的含量测定

王璐

目的探讨高压液相色谱法(HPLC法)在芩霍双清饮中黄芩苷含量测定中的应用情况。方法采用HPLC法, 选取Merk C作为色谱柱, 以体积比为2:3的甲醇(CH3OH)与浓度为0.3%的磷酸溶液作为流动相, 混合溶液流速为1 ml/min, 检测波长λ=280 nm。对此种方法下的黄芩苷含量进行测定分析。结果黄芩苷平均回收率为97.65%, 平均标准偏差(RSD)为0.67%。结论HPLC法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量, 方法简便、确切以及重现性较好, 可应用于芩霍双清饮中黄芩苷的定量测定与分析之中, 应加以推广及应用。

高效液相色谱法；芩霍双清饮；黄芩苷

芩霍双清饮为临床上较为常见的一种中药制剂, 其主要成分为黄芩苷。具有清热燥湿、泻火解表之功效, 对寻常型痤疮、脓疱型痤疮有良好的治疗效果［1］。本研究主要采用高效液相色谱法对其中的黄芩苷含量进行测定分析, 现将结果报告如下。

1 仪器与方法

1.1仪器 HPLC色谱仪：Waters色谱仪；色谱检测器：Waters-2847紫外检测器；色谱工作站：Waters-2695色谱工作站；色谱柱：Merck-C18, 规格为150 mm×4.6 mm；纯水机；电子天平等仪器。

1.2药品 对照药品：黄芩苷(批号：20130318, 本院自行研制)；试剂：CH3OH、磷酸、C2H5OH(AR)以及超纯水等。

1.3方法

1.3.1色谱条件的选择 色谱柱：Merck-C18, 规格为150 mm×4.6 mm；流动相：CH3OH+0.3%磷酸溶液(溶液体积比为2:3)作为流动相；色谱柱温度设置为30℃；流速设置为1 ml/min；波长：280 nm；进样量设置为每次进样10 μl［2］。

1.3.2供试品溶液的制备 准确地取2 ml供试品溶液, 将其加入至50 ml的容量瓶之中, 再向其加入浓度为70%的C2H5OH溶液之中, 并调节至刻度, 摇匀, 定容；再准确地取2.5 ml的续滤液, 并将其加入50 ml的容量瓶之中, 并加入浓度为70%的C2H5OH稀释至刻度线处, 定容, 然后用孔径为0.45 μm的微孔滤膜, 吸取滤液, 则可得到供试品溶液［3］。

1.3.3对照品溶液的制备 分别准确称取黄芩苷对照品置于一定容积的量瓶之中, 使用CH3OH来配置单组份对照品贮备液, 其浓度分别为2.67、1.04、1.31 mg/ml。然后分别准确地量取一定量的各单组分对照品贮备液, 并将其配制成混合对照品溶液, 其中黄芩苷为0.40 mg/ml。

1.3.4阴性对照干扰试验 根据处方比例以及制备工艺,并配制成为不含有黄芩苷的阴性对照样品, 根据“1.3.2”方法制备成为阴性对照溶液。在“1.3.1”方法的色谱条件下,分别吸取对照品溶液、阴性对照溶液各为10 μl, 注入液相色谱仪, 根据含量测定的方法对其进行测定分析。

1.3.5线性相关性分析 取“1.3.3”下的对照品溶液, 分别进样2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μl, 并对色谱的峰面积进行测定分析, 以对照品进样量作为横坐标, 峰面积作为纵坐标, 并绘制出标准曲线, 从而得到回归方程, 利用Excel软件计算相关性系数。

1.3.6精密度试验分析 准确地测定10 μl对照品溶液, 并将其注入至色谱仪之中, 连续重复测定6次, 并测定器峰面积以及计算相对标准偏差RSD［4］。

1.3.7加样回收试验 准确地称取已知含量的本研究中选择的中药合剂6份, 每份的量均为1 ml, 分别准确地加入黄芩苷对照品, 根据“1.3.2”中的方法来制备供试品溶液。计算回收率。

1.4统计学方法 所有数据均采用SPSS18.0软件进行统计分析。利用Excel软件计算相关性系数。进行线性回归分析。

2 结果

2.1线性关系 取混合对照品溶液分别将其稀释至3、5、10、15、20、25倍, 根据上述色谱条件, 均进样20 μl, 对其峰面积进行测定、分析, 将峰面积积分值作为横坐标(X), 进样量(μg)作为纵坐标(Y), 对其进行线性回归分析, 具体结果见表1。

2.2HPLC法下的加标回收率试验结果 黄芩苷平均回收率为97.65%, 平均标准偏差(RSD)为0.67%, 见表2。

表1 各个组分线性关系分析结果

表2 HPLC法下的黄芩苷加标回收率试验结果(n, %)

3 讨论

据文献报道, 用HPLC法测定含芩霍双清饮中黄芩苷的含量, 方法简便, 结果准确, 可有效控制药品质量, 确保疗效［5］。因此, 作者测定芩霍双清饮中中黄芩苷的含量方法完全按照《中国药典》 规定的色谱条件进行, 即检测波长为280 nm。在此色谱条件下, 黄芩苷主峰无干扰, 理论塔板数均在2000以上, 主峰前、后分离度均＞2, 完全达到药典含量检测的规定和要求［6］。在实际的操作过程中, 还应注意一些问题, 如采用纯甲醇和流动相两种溶剂分别对样品进行超声提取, 结果显示, 仅仅用甲醇超声提取, 样品提取不是很完全, 选用流动相先加热回流3 h, 提取率高, 再测定黄芩苷的含量, 为了避免其他成分的干扰, 每针样品进样分析时间不得＜35 min。

黄芩为芩霍双清饮合剂中的主药之一, 黄芩苷为其主要活性成分之一, 具有抗菌抗炎、清热解毒的作用［3］, 采用HPLC法对黄芩中的主要成分黄芩苷进行含量测定。取黄芩苷对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行波长扫描, 图谱中黄芩苷在280 nm波长处有较大吸收, 故以280 nm为检测波长［4］。曾试用Kromasil Cl8、Merck Cl8、CAPCELL PAK C18等多种品牌的色谱柱, 各色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好, 分离理想, 本实验色谱柱采用Merck C18色谱柱。

实验中发现溶解样品的溶剂对黄芩苷的峰形有很大影响, 若只以甲醇作为溶剂, 黄芩苷的色谱峰会出现明显肩峰,而改用流动相作为溶剂后, 肩峰完全消失, 峰形明显改善。此外, 在样品的制备过程中发现加入甲醇后, 样品会出现较多的絮状沉淀, 易阻止黄芩苷的进一步析出和溶解, 若直接过滤, 将导致黄芩苷的溶解不完全, 使样品回收率偏低。本文采用超速离心并进一步用甲醇洗涤沉淀进行处理, 可使回收率大大提高, 结果理想, 重现性好。

综上所述, HPLC法测定芩霍双清饮中黄芩苷的含量,方法简便、确切以及重现性较好, 可应用于芩霍双清饮中黄芩苷的定量测定与分析之中, 应加以推广及应用。

［1］ 黄雄, 黄嬛, 黄佳, 等.HPLC 同时测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量.中国现代应用药学杂志, 2009, 26(5):417-419.

［2］ 张婷, 美尔哈巴·热西提, 林潇, 等.HPLC-MS /MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷.中草药, 2012, 43(4):711-713.

［3］ 张静, 刘文翔, 韩艳婷, 等.HPLC 测定银黄口服液中绿原酸、黄芩苷和木犀草苷的含量.西北药学杂志, 2011, 26(4):237-239.

［4］ 魏大华, 冯敬文, 王四元, 等.小儿清热利肺口服液中总绿原酸的含量测定方法研究.广东药学院学报, 2010, 26(4):373-376.

［5］ 胡世强, 张伟, 张永耀.RP-HPLC 法同时测定不同厂家银黄颗粒中绿原酸、木犀草苷和黄芩苷的含量.今日药学, 2013, 23(8): 490-493.

［6］ 付艳敏, 李伯军.HPLC法测定双黄消炎片中黄芩苷的含量.中国药师, 2008, 11(6):654-655.

2014-06-24］

473000 南阳市中医院药剂科