采用SMART技术克隆HDAC抑制剂抗肿瘤效应核心作用靶点的研究

张国祥

采用SMART技术克隆HDAC抑制剂抗肿瘤效应核心作用靶点的研究

张国祥

目的探讨通过自我监测、分析及报告技术(SMART技术)寻找抵抗组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂抗肿瘤的效应基因。方法曲古柳菌素(TSA)诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡30例, 收集不同时段凋亡细胞提取信使核糖核酸(mRNA), 构建反义互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库, 筛选出阳性转染细胞克隆, 提取Hirt DNA, 转化感受态细菌测序, 选择核心靶位基因, 探讨作用机制。结果建立反义cDNA文库, Annexin V作用丁酸钠选择性诱导MCF-7不同时间段凋亡率与HEF比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论采用SMART技术克隆HDAC抑制剂抗肿瘤效应核心作用强。

SMART技术；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；抗肿瘤；作用靶点

1 材料与方法

1.1试验器材与试验材料 人乳腺癌细胞株MCF-7, 人宫颈癌细胞株HeLa, 正常乳腺上皮细胞MCF-10A均购于美国物种保存中心。

1.2方法

1.2.1AnnexinV诱导肿瘤细胞凋亡特异性检测 试验AnnexinV诱导MCF-7、HeLa、HEF细胞凋亡不同时间段的凋亡率, 采用MTT检测各浓度作用后0、24、48、72 h MCF-7、HeLa、HEF细胞生长曲线及凋亡率的变化。

1.2.2MTT法 胰酶消化处于对数生长期MCF-7细胞, 后微量加样器吸取100 μl消化后的MCF-7细胞加入96孔板中。显微镜下观察细胞贴壁生长后, 采用二甲基亚砜(DMSO)以及不同浓度的TrichostatinA 5%胎牛血清DMEM培养基进行稀释, 在0、24、48、72 h各个时段将一个孔板中的培养液弃去, 加入100 μl MTT溶液或孔后放置于37℃孵育箱中孵育, 时间持续为6 h。后将上清液净化弃去, 微量加样器将150 μl DMSO加入孔板中, 轻轻振荡, 后采用Biotek酶标仪在波长为570 nm处测定溶液OD值。经Tricho0statinA处理过的细胞在0、24、48、72 h时间段分别对细胞进行收集, Annexin-V双染色, 染色成功后放置于流式细胞仪器中进行细胞凋亡数量的检测。

1.2.3Annexin V双染色法 在经处理后的MCF-7、HeLa、HEF细胞培养0、24、48、72 h, 分别用0.25%胰酶消化, 进行PBS洗涤1次, 调节细胞密度至106/ml, 取100 μl细胞悬液放置于EP管中, 加入5.0 μl的Annexin V溶液丁酸钠选择性后闭光静置15 min, 加入200 μl banding buffer终止, 后静置60 min内上机进行检测。

1.2.4反义cDNA文库的构建 主要包括细胞模型的处理和细胞的收集, mRNA提取, cDNA第一链和第二链的合成, cDNA末端补平和接头的连接, cDNABamH I/HindIII双酶切, pCEP4的BamH I/HindIII双酶切, 点转感受态细胞的制备, cDNA和pCEP4的连接和转化, 重组克隆的鉴定和库容分析,文库DNA提取和纯化。

1.2.5HDAC抑制剂作用的核心作用靶点 将测序结果中检测出的已知基因结合生物学信息学分析, 选择出16个进行效应的验证, 主要方法包括16个克隆提取质粒, 采用电击转化的方法转染HeLa细胞, TrichostatinA筛选细胞克隆, 加入不同浓度进行筛选, pCEP4-CAT转染细胞作为TrichostatinA作用的对照细胞, 查找HDAC抑制剂抗肿瘤效应核心作用靶点。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

Annexin V作用丁酸钠选择性诱导MCF-7、HeLa、HEF细胞不同时间凋亡率比较, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 Annexin V作用丁酸钠选择性诱导MCF-7、HeLa、HEF细胞不同时间凋亡率

表1 Annexin V作用丁酸钠选择性诱导MCF-7、HeLa、HEF细胞不同时间凋亡率

注：与HEF比较,aP＜0.05

细胞类型0 h24 h48 h72 h HEF 5.7±1.2 7.7±2.310.3±2.511.5±3.6 HeLa10.6±2.516.4±2.542.1±4.6a89.0±4.4aMCF-712.3±2.428.8±3.4a53.1±2.2a78.2±3.3a

3 小结

通过建立细胞的反义基因表达文库并将文库转入细胞的方法, SMART同目前通用的基因差异表达分析方法不同, 注重从功能角度分离效应基因, 无论基因表达变化多么复杂,均能精确找到关键的效应基因。该技术为克隆HDAC抑制剂的效应分子, 提供了一种合理、可靠的技术手段。

管cDNA噬菌体文库及芋螺毒素新基因的克隆.中国生物化学与分子生物学报, 2012, 28(5):484-488.

［2］ 周剑锋, 刘文励.ATM缺失介导的U937细胞凋亡敏感性增强依赖于异常的细胞周期蛋白依赖性激酶.中华血液学杂志, 2002, 15(1):16.

2014-06-04］

510370 广州市荔湾区人民医院

［1］ 李宝珠, 高炳淼, 吴勇, 等.利用SMART技术构建疣缟芋螺毒