阿司匹林对小鼠胚胎腭裂发生的作用研究

万 哲， 陈莉娜， 龚新记， 塔拉甫·托坎， 林 晨

(新疆医科大学1附属中医医院口腔科， 乌鲁木齐 830000； 2临床医学院临床医学2011-4班； 3临床医学本硕2010-2班；4基础医学院病理学教研室， 乌鲁木齐 830011)

腭裂动物模型的建立在腭裂病因学、发病机制及临床治疗等研究中具有重要的作用[1]。腭裂的发生主要是由于胚胎早期发育过程中腭突融合障碍所致,一般是遗传及环境因素相互作用的结果,其中妊娠早期误服药物也可能是其发生原因之一。胚胎腭器官发生期是器官的形成阶段, 同时又是胚胎致畸的敏感阶段。阿司匹林可引起实验动物的致畸作用和生长发育迟缓。以往的研究显示，阿司匹林易通过胎盘引起动物畸形，表现为露脑及脑膨出、脊椎裂、腹裂、尾部弯折、肢体外翻，其中以神经系统畸形最为明显[2]。目前阿司匹林已作为致畸实验的阳性物使用[3]，但阿司匹林致先天性腭裂的模型尚未建立。本实验旨在研究不同剂量阿司匹林对小鼠胚胎腭裂形成的作用，确立最佳浓度，为小鼠腭裂动物模型的建立和开展后续研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1实验材料实验用药：阿司匹林(acetyl salicylic acid，Sigma A5376,USA,纯度≥99%，规格：100 g)。实验动物：SPF级BALB/C小鼠购自新疆医科大学实验动物中心，8～10周龄，体质量均≥22 g。

1.2实验方法

1.2.1 小鼠饲养 小鼠饲养在(25±2)℃和人工调控12 h昼夜循环条件下，给予充足水和食物。将未交配生育过的雌雄小鼠以5∶2的比例合笼，次日晨检查雌鼠，有阴道栓者记为胚胎第0天(embryo 0，E0)，标记并称体质量，取出单独饲养。胚胎第10天(E10)时体质量增加<2 g者判定为假孕，取出重新交配，体质量增加≥2 g者判定为受孕，用于后续实验。

1.2.2 分组及给药 将50只孕鼠随机分为5组，即对照组和实验Ⅰ～Ⅳ组，每组10只孕鼠。胚胎第10～12天(E10～E12)时，每天早上8时给予对照组孕鼠灌胃生理盐水，实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组孕鼠分别灌胃阿司匹林180、210、240、270 mg/kg。灌胃量按10 mL/kg体质量计算。

1.2.3 标本收集和分析 E18时称重孕鼠后以断颈法处死，完整分离胚胎和子宫，称量胚胎总重量，记录胚胎总体质量及孕鼠增加体质量(E18孕鼠体质量-胚胎总重量-E10孕鼠体质量)，并计算每个胚胎的重量。取出的胚胎剪掉下颌和舌，在光学显微镜下观察胚胎腭裂的发生情况。

1.2.4 切片与染色 制作方法: 将剪下的下颌放于梯度酒精脱水、浸蜡后常规石蜡包埋,包埋时小鼠喙部朝下。包埋好后准备用于切片,切片时以麦克尔软骨为基准面, 作冠状位连续切片,切片厚约6 μm。石蜡切片经脱蜡、水化、蒸馏水洗涤、苏木精染色、自来水洗、0.5%盐酸酒精分化、自来水蓝化、伊红染色、脱水、透明、封片，光镜观察。

1.3统计学处理采用SPSS 16.0统计软件对孕鼠及胎鼠体质量变化进行方差分析。对腭裂的发生情况进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1孕鼠体质量的变化实验组E18孕鼠增加体质量均低于对照组E18。对照组孕鼠体质量增加最多，为(5.67±1.10) g；实验Ⅰ组其次，为(5.45±0.82) g；实验Ⅳ组孕鼠体质量增加最少，为(2.86±1.50) g。对照组和实验Ⅰ、Ⅱ组孕鼠增加体质量比较差异无统计学意义(F=1.546，P>0.05)，但实验Ⅲ、Ⅳ组孕鼠增加的体质量低于对照组和实验Ⅰ、Ⅱ组，差异具有统计学意义(F=8.421，P<0.05)。

2.2胎鼠体质量变化分析对照组胎鼠体质量最大，为(2.23±0.22) g，实验Ⅳ组胎鼠体质量最小，为(1.98±0.50) g，随着阿司匹林剂量增加胎鼠体质量降低，但其差异无统计学意义(F=2.597，P>0.05)。

2.3胚胎腭裂发生情况对照组胎鼠的腭裂发生数与实验Ⅰ、Ⅱ组比较，差异无统计学意义(χ2=1.231,P>0.05；χ2=0.992,P>0.05)。对照组腭裂发生率明显低于实验Ⅲ、Ⅳ组，差异有统计学意义(χ2=15.057，P<0.01；χ2=17.551，P<0.01)。实验Ⅲ组腭裂发生率高于实验Ⅳ组，差异有统计学意义(χ2=4.742，P<0.01)。在给予孕鼠灌胃240 mg/kg和270 mg/kg阿司匹林后，胎鼠的腭裂发生率明显上升，见表1。

表1 各组胎鼠腭裂分布情况/只(%)

注：与对照组比较，*P<0.01； 与实验Ⅲ组比较，△P<0.01。

2.4光镜组织学观察结果E18时对照组可见到1只胚胎发生腭裂，其余胚胎正常腭突正常融合，可见两侧腭突延伸至鼻中隔，与鼻中隔完全相融合，将口腔和鼻腔完全分开，见图1。实验Ⅲ组发生腭裂最多，实验Ⅰ组发生数最少，发生明显腭裂的胚鼠标本可见两侧腭突形态小，腭部正中有一边缘不太规整的裂隙,未能与鼻中隔完全相融合，其长度、宽度不一,长度一般为 1～5 mm，见图2、3、4。

图1 对照组小鼠腭部正常融合(HE×40)

图2 实验Ⅰ组小鼠腭部未完全融合(HE×40)

图3 实验Ⅱ组小鼠腭部未融合(HE×100)

图4 实验Ⅲ组小鼠腭部未融合(HE×100)

3 讨论

人与动物组织胚胎学研究已证明双侧腭突的融合失败是导致腭裂发生的直接原因，其发生主要是由于腭突中嵴上皮(MEE)细胞分化异常的结果[4]。腭裂的发生具有较强的遗传因素，此外一些环境因素也成为唇腭裂发生的重要因素，例如孕妇在孕期吸烟、酗酒、服用药物、接触某些化学物质[5]。阿司匹林能引起动物胚胎致畸，对动物母体也具有较强的生殖毒性，能够明显地增加死胎数、吸收胎数，降低活胎数。大剂量或长期服用阿司匹林可导致孕妇贫血、孕期增长、胎盘早剥增加[6-7]。但致小鼠腭裂的模型和机制尚未形成。

本研究发现，高剂量阿司匹林能减轻孕鼠体质量；胎鼠体质量与阿司匹林剂量呈相反趋势；随着阿司匹林剂量的增加，腭裂的发生率增高,其差异具有统计学意义。最高剂量和最低剂量均未获得明显的腭裂致畸效果。高浓度阿司匹林导致胚胎的死亡增多，获取的腭裂小鼠数量减少；低浓度阿司匹林致胚胎存活率上升，但致畸率下降。不同剂量的阿司匹林对小鼠腭裂致畸强度有差异，说明阿司匹林对小鼠腭裂的致畸存在最佳的致畸浓度。本研究结果显示，实验Ⅲ组的致畸率较高，死亡率最低，致畸效果稳定，相对符合理想致畸物的标准。故认为240 mg/kg为本实验致小鼠腭裂的最佳浓度。这可能与阿司匹林能够抑制胚胎时期组蛋白的脱乙酰基酶，从而干扰了核心组蛋白的脱乙酰化，改变了染色体的结构，发生蛋白质异常表达，造成胚胎时期畸形有关[8]。所以阿司匹林导致腭裂形成机制可能是多种途径导致细胞的分化和增殖发生异常。

阳性致畸物的选择是致畸实验的关键，目前供致畸实验的阳性致畸物的选择较多，但针对药物药理作用或作用部位的选择一个针对性强、致畸率高且死亡率低的阳性致畸物却是一个难题。在规定剂量下以维生素A作为阳性致畸物致畸效果也较稳定，但对孕鼠生殖能力、胎鼠身长、体质量均无明显影响(P>0.05)。阿司匹林不仅能影响孕鼠生殖能力，还能影响胎鼠发育，尤其对胎鼠骨骼发育影响显著[9]，也能促进口腔腭裂形成，这说明阿司匹林作为致畸实验的阳性致畸物是成功的，对研究胚胎腭裂的动物模型建立有一定的价值和意义。

参考文献：

[1] 朱江波,张天宝. 腭裂动物模型的研究现状[J]. 国外医学口腔医学分册, 2005, 32 (2):133.

[2] 赵敏,陈壁锋,谭剑斌,等. 阿司匹林对SD大鼠致畸作用最佳剂量的筛选[J]. 癌变·畸变·突变, 2010, 22 (6):469-472.

[3] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会，GBl5193．1-15193．21食品安全性毒理学评价程序和方法[S]．北京：中国标准出版社，2003：89-94．

[4] 文佳冰,张文广. 唇腭裂发病机制的研究进展[J]. 医学综述, 2013, 19 (12):2183-2187.

[5] 王丽君,黄金龙,万伟东. 非综合征性唇腭裂的遗传因素和环境因素研究进展[J]. 国外医学遗传学分册, 2005, 28 (2):102-120.

[6] 曲明. 阿司匹林在妇产科应用及安全性[J]. 求医问药, 2012, 10 (9):161.

[7] 覃少华,韦裕强,赵云霞,等. 阿司匹林大鼠灌胃给药胚胎-胎仔发育毒性[J]．中国药理学与毒理学杂志, 2013, 27 (3):573-574.

[8] Renzo FD,Cappelletti G,Broccia ML，et al. The inhibition of embryonic histone deacetylases as the possible mechanism accounting for asial skeletal malformations induced by sodium salicylat[J]. Toxicol Sci, 2008, 104 (2):397-404.

[9] 李超,潘建明,张相年,等. 阿司匹林建立大鼠胚胎畸形模型研究[J]. 中国药师, 2010, 13 (2):224-227.