香鱼巨噬细胞炎性蛋白-2基因的克隆、序列分析及表达

王世会 史雨红 陈炯

（宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波 315211）

趋化因子（Chemokines，CK）是一类能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，从1986年发现第一个趋化因子至今，至少已经发现了60种趋化因子。其中趋化因子家族成员巨噬细胞炎性蛋白（Macrophage inflammatory protein，MIP）是由Wolpe等［1]于1988年首次发现的。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激鼠巨噬细胞系RAW264.7后，用肝素亲和柱分离出了两种新的蛋白质MIP-1和MIP-2。这两种蛋白质分别占巨噬细胞分泌蛋白质的5%和2%［1，2]。通过这种方法他们所获得的MIP-2是一分子量6 kD、成熟蛋白含有73个氨基酸残基的碱性蛋白［3]。MIP-2具有重要的生理作用，可以特异性地趋化中性粒细胞到炎症部位，从而消除炎症反应。Lentsch等［4]提到，小鼠由于局部出血而引起肝组织损伤中，MIP-2蛋白可以特异性地驱动白细胞到达炎症部位，消除炎症反应。同时在病毒性侵染导致的免疫应答反应中，病毒可以引起趋化因子MIP-2蛋白的表达量上调，影响免疫细胞杀伤病毒的能力，提高寄主对病毒的抗性［5]。小鼠在注射接种柯萨奇B3病毒（CVB3）14 d后，心肌组织MIP-2基因mRNA表达量显著上调［6]。除了具有趋化作用外，在造血调控中MIP-2也发挥着作用。Broxmeyer等［7，8]认为MIP-2起到与其它造血因子协同或影响的作用。目前，关于MIP-2的文献报道以人和鼠为主，而鱼类MIP-2基因只能从数据库中检索到相关序列，暂无相关文献报道。

香鱼（Plecoglossus altivelis，Sweetfish）隶属胡瓜鱼目香鱼科，是东亚地区中国、日本和朝鲜等国家特有的一种小型经济名贵鱼类［9]。近年来在中国的养殖面积日益增加，但病害问题严重。其中鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）是养殖香鱼的主要病原菌之一，对香鱼养殖业造成巨大的经济损失［10]。与直接使用化学试剂防治病害相比，免疫学方法对鱼体和食用者更安全，对环境更环保。因此，本研究对香鱼MIP-2基因进行序列分析，分析其mRNA表达与鳗利斯顿氏菌感染相关性；采用原核表达获得香鱼MIP-2蛋白，制备香鱼MIP-2抗血清，旨为进一步深入研究香鱼MIP-2蛋白功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

健康香鱼购自宁海凫溪香鱼养殖场；ICR小鼠购自宁波大学实验动物中心；鳗利斯顿氏菌香鱼分离株sweetfish-H080701、大肠杆菌Top10和BL21 pLys E菌株、原核表达载体pGEX-3X等由本实验室提供；RNAiso试剂、SYBRPremix Ex Taq试剂盒、AMV逆转录酶等购自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit购自Omega公司；辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中山金桥生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒、显影定影试剂盒、柯达X-OMAT BT胶片和压片暗盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 购回的香鱼在实验室中饲养1周，随机选取3尾健康香鱼，采集心、肝、鳃、肾、脑、脾、肌肉、肠等组织，投入液氮中，随后转入超低温冰箱中保存。剩余的香鱼均分为试验组和对照组，每3尾一组，试验组每尾腹腔注射100 μL鳗利斯顿氏菌悬液（1.0×105CFU/mL PBS），对照组每尾注射100 μL PBS溶液。分别于注射后4、8、12和24 h取样，取样方法同上。

1.2.2 香鱼MIP-2基因序列分析 利用巨噬细胞转录组测序获得香鱼MIP-2基因序列，采用PCR方法从香鱼巨噬细胞cDNA中扩增后测序验证，经分析所获得的序列与转录组测序结果一致［11]。信号肽序列预测采用SignalP 4.0在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。用MEGA 4.0软件［12]进行多重序列比对和系统进化树构建，所需基因序列信息，见表1。

表1 基因、物种、登录号信息

1.2.3 香鱼MIP-2基因mRNA的组织表达特征分析采用RNAiso试剂提取香鱼总RNA，随后用DNase I处理，再以oligo（dT）30为引物合成第一条cDNA链。根据MIP-2基因ORF序列设计扩增引物MIP-2-text-F（5'-CAGAGTCCTGATGCTCCTTGC-3'）和MIP-2-text-R（5'-CCAGTCTTATCTTGGGGTCGA-3'），预计扩增片段长度为224 bp。以β-actin基因（AB020884）为内参设计引物，pActin2（+）5'-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3'和pActin2（-）5'-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3'，预期扩增片段长度为231 bp。实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测MIP-2基因mRNA在香鱼各组织中的表达变化。

1.2.4 与鳗利斯顿氏菌侵染相关的香鱼各组织MIP-2基因mRNA的表达变化 取腹腔注射后不同时间的香鱼各组织，检测MIP-2基因mRNA表达量的变化。采用实时荧光定量PCR来研究鳗利斯顿氏菌感染过程中香鱼各组织MIP-2基因mRNA转录水平的表达变化情况。由程序MxPro 3.2读取荧光定量结果，结果分析采用相对标准曲线法2-DDCt［13]，获得香鱼各组织MIP-2基因mRNA的相对表达量。试验结果采用SPSS单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计，P<0.05为显著差异。

1.2.5 香鱼MIP-2基因的原核表达和抗血清制备 设计原核表达引物pGEX-3X-MIP-2（+）5'-CGCCATGACAACCAGAGTCCTGAT-3'和pGEX-3X-MIP-2（-）5'-GTCAGACTGTGTCTGGAA GCA-3'（下划线限制性内切酶EcoR I和BamH I的识别序列），以香鱼肾组织cDNA为模板，PCR扩增MIP-2基因，预期大小产物（318 bp）经2%（W/V）琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶纯化。纯化产物经连接、转化、测序验证等步骤后，用BamH I和EcoR I双酶切，回收的MIP-2片段插入到同样双酶切的pGEX-3X中，获得重组质粒pGEX-3X-MIP-2。转化大肠杆菌BL21 pLys E后IPTG （终浓度0.4 mmol/L）诱导，SDS-PAGE检测。预期大小的蛋白切胶纯化后免疫小鼠，制备抗血清［9]。

1.2.6 蛋白质印迹 12% SDS-PAGE分离胶中分离蛋白，采用湿转法转PVDF膜。转膜结束后用封闭液（含5%脱脂奶粉配制的PBST缓冲液），37℃封闭2 h。一抗（MIP-2小鼠抗血清）4℃孵育过夜，PVDF膜用PBST缓冲液清洗，每次10 min，共3次。随后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h。再用PBST清洗，每次10 min，共3次。加上ECL于暗室显影。

2 结果

2.1 香鱼MIP-2基因cDNA序列分析

MIP-2基因开放阅读框的序列长度为318个核苷酸，编码一个由105个氨基酸组成、相对分子质量为11.6 kD的前体蛋白。用Signal P信号肽预测软件预测前体蛋白N端19个氨基酸为信号肽序列，信号肽的剪切位点是第19位的谷氨酰胺（Gln），成熟肽MIP-2预测相对分子质量为9.4 kD。通过多重序列比对分析（图1），可以看到CXC型趋化因子的典型结构区域。

图1 与MIP-2同源的氨基酸序列多重序列比对

氨基酸序列分析表明，香鱼MIP-2与白斑狗鱼（Esox lucius）MIP-2同源性最高，达54%。与其它鱼类MIP-2的同源性介于39%-41%之间，与哺乳动物MIP-2的同源性低于34%。系统进化树（图2）分析揭示，香鱼的MIP-2和其它鱼类中的MIP-2和IL8、IL-8like比较接近，而和哺乳动物的相关基因则相差较远。

2.2 香鱼MIP-2基因mRNA组织表达特征

图3结果显示MIP-2基因mRNA在各组织表达量有差异。健康香鱼MIP-2基因mRNA在脾、肾、脑、鳃组织中表达量较高，在肝、心、肌肉和肠中表达量相对较少。

图2 基于NJ法构建的MIP-2蛋白氨基酸序列系统进化树

图3 香鱼MIP-2基因mRNA的组织表达特征

2.3 鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织MIP-2基因mRNA的表达变化

鳗利斯顿氏菌感染香鱼后，鱼鳍基部出现充血发红、 肌肉腐烂等典型的细菌败血症症状，而对照香鱼未出现异常现象。由实时荧光定量PCR结果可知，鳗利斯顿氏菌侵染香鱼后，各组织中MIP-2基因mRNA出现不同程度表达上调。尤其是在肾组织和肌肉组织中上调最显著，最高值分别为对照组的23和25倍。此后表达量上调趋缓，趋向恢复到对照组表达水平。而在心、鳃和肝组织中，8 h的表达量分别为对照组的15.5、13和11倍。其它组织脾、脑、肠中也都呈上调趋势，最高值分别是对照组的5、4.3和6.8倍（图4）。

2.4 香鱼MIP-2基因的原核表达

重组质粒测序验证后，转化进入大肠杆菌BL21 pLys E中，经IPTG诱导表达，在12% SDS-PAGE分离胶中观察到一条约为37 kD的融合蛋白条带（图5-A），与预测的MIP-2融合蛋白相对分子质量吻合（37.3 kD）。该蛋白条带切胶纯化后免疫小鼠，制备抗血清。Western blotting检测抗血清（图5-B）。

3 讨论

系统进化树分析表明，香鱼MIP-2和白斑狗鱼的MIP-2同源性最高，同时和其它鱼类的IL-8、IL8-like也具有较高的同源性。由于转录组测序结果中，我们获得了与IL8同源性更高的序列，因此，暂将该基因命名为MIP-2，其蛋白特性还需进一步验证。此外，据相关文献报道，鼠中的MIP-2和人类的IL8具有很高的同源性［14]，而鼠中的IL8一直未发现，所以有可能鼠中的MIP-2和人类中的IL8发挥着同样的作用［15]。

本文研究表明，鳗利斯顿氏菌侵染后，香鱼各组织中MIP-2基因mRNA表达量均出现显著上调，说明MIP-2基因mRNA表达变化与鳗利斯顿氏菌侵染香鱼的急性反应相关。MIP-2基因mRNA与细菌感染相关性文献主要集中对哺乳动物小鼠和大鼠的研究，鱼类暂无相关报道。大肠杆菌感染小鼠肾组织2 h时，MIP-2基因mRNA的表达上调29倍［16]。Rovai等［17]将LPS注射进入小鼠体内后，小鼠肺、心、肝、脾组织MIP-2基因表达均在感染后2 h出现显著上调，随后上调趋势逐渐放缓。由b型流感嗜血杆菌所引起的小鼠脑膜炎病症中，Diab等［18]发现MIP-2基因在感染12 h时上调表达，48 h达到峰值，7 d表达量趋近于正常水平。此外，关于MIP-2参与防御细菌感染的分子机制也有报道。在由克雷伯氏细菌引起的小鼠肺炎中，MIP-2蛋白表达显著上调，同时可调节中性粒细胞抵达肺部清除病菌［19]。大鼠小肠感染病菌后，上皮细胞分泌MIP-2蛋白，调节中性粒细胞进入到小肠以清除病菌［20]。通过对小鼠的研究发现MIP-2发挥免疫功能的机制是趋化中性粒细胞到炎症部位，从而消除炎症反应。因此我们推测，香鱼MIP-2蛋白可能也具有类似机制，但还需进一步验证。

原核表达作为最经典、最成熟的蛋白表达系统被广泛用于分子生物学和基因工程等研究。通过原核表达获得目的蛋白，制备抗血清，进而采用血清学方法检测，为进一步深入研究蛋白功能奠定了基础［21]。因此，本研究通过原核表达获得香鱼MIP-2蛋白，制备香鱼MIP-2抗血清，为研究MIP-2在香鱼抗菌免疫中的作用奠定了基础。

图4 实时荧光定量PCR分析鳗利斯顿氏菌侵染前后香鱼各组织MIP-2基因mRNA表达变化

图5 香鱼MIP-2基因的原核表达的分析（A）SDS-PAGE和抗血清（B）的检测

4 结论

从香鱼巨噬细胞转录组测序结果中获得香鱼MIP-2基因。序列分析表明，香鱼MIP-2具有已知的CXC型趋化因子特征性结构，即含CXC的结构。系统进化树分析表明，香鱼MIP-2和白斑狗鱼的MIP-2同源性最高，同时和其它鱼类的IL-8、IL8-like也具有较高的同源性。组织表达特征研究揭示，健康香鱼MIP-2基因mRNA主要在脾、肾、脑、鳃组织中表达，在肝、心、肌肉、肠组织中表达次之。研究表明，被鳗利斯顿氏菌侵染后，香鱼各组织中MIP-2基因mRNA表达量均出现显著上调，说明MIP-2基因mRNA表达变化与鳗利斯顿氏菌侵染香鱼的急性反应相关。

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