补肾益气活血中药对大鼠脑缺血再灌注损伤后VEGF的动态变化与BBB通透性改变的影响

龚惠娥

[摘要] 目的 探讨补肾益气活血中药对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子（VEGF）的动态变化与血脑屏障（BBB）通透性改变的影响。方法 将大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、中药组，采用线拴法建立脑缺血模型。采用伊文思蓝（EB）荧光测定法分别对大鼠脑组织进行缺血再灌注1、3、7d后的EB含量变化情况进行检测；采用免疫组织化学方法测定大鼠脑缺血再灌注不同时间点VEGF的表达情况。结果 生理盐水组和中药组大鼠再灌注1、3、7d后湿脑组织中EB含量分别为（4.69±0.97）μg/g、（5.89±1.13）μg/g、（3.97±0.67）μg/g和（3.32±1.43）μg/g、（4.27±1.48）μg/g、（3.19±0.64）μg/g，均高于假手术组的（2.12±0.45）μg/g （P <0.05）。中药组大鼠湿脑组织中EB含量在同一时间点均明显低于生理盐水组（P <0. 05）。 结论 补肾益气活血中药可通过对血脑屏障功能的改善减轻血管源性脑水肿。

[关键词] 脑缺血再灌注；血管内皮生长因子；血脑屏障

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0001-03

缺血性脑血管病一个重要致病因素就是脑缺血再灌注，其损伤后修复与血管内皮生长因子（VEGF）变化情况和血脑屏障（BBB）的通透性有密切联系[1]。本研究通过对损伤后大鼠VEGF的动态变化与BBB通透性的测定，探讨补肾益气活血中药在缺血性脑血管病中的作用。现报道如下。

1材料与方法

1.1一般资料

选用清洁级健康雄性Wistar大鼠（上海义森生物科技有限公司）。大鼠体重260～310g，鼠龄7～11周，实验前在清洁级动物房内适应1周。大鼠随机分为假手术组12只，生理盐水组36只，中药组36只。各组大鼠均分为两小组，经缺血90min再灌注1、3、7d。

1.2方法

1.2.1建立模型 建立模型参照改良的Longa法[2]。用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。暴露左侧颈总动脉，结扎近心端，动脉夹夹于远心端。剪开小口，插入15 mm尼龙丝线，外留15～20mm。近心端结扎该动脉，全层缝合切口，抽出尼龙丝线至颈内动脉起始部。维持实验室室温为（23±1）℃。大鼠出现左侧Horner征为成功标准[3]。

1.2.2给药方法 生理盐水组和中药组分别以1.67mL/kg、2次/d腹腔注射生理盐水和补肾益气活血中药。

1.2.3 VEGF的动态变化测定 VEGF的检测方法采用免疫组化SABC进行。染色按试剂盒说明进行。大鼠到达灌注时间点后采用10%水合氯醛（350mg/kg）进行麻醉。用4%多聚甲醛（PBS，0.1mol，pH7.4）固定48h。石蜡包埋，取视交叉平面观察。VEGF蛋白染色呈棕黄色颗粒，取高倍镜下缺血区5个视野里阳性细胞数，计算均值并记录。

1.2.4血脑屏障通透性测定 采用EB为标踪剂，各小组随机取8只大鼠，按20mg/kg自尾静脉注入2%EB液，2h后处死。标准：大鼠结膜、四肢等呈蓝色。取染色后大鼠脑左半球称重、粉碎，加入甲酰胺（25mg/1mL），加盖避光，37℃水浴72h。参照说明书用荧光分光光度仪测定提取液的荧光强度并记录。用倍比稀释法做出EB浓度标准曲线，计算EB浓度的线性回归方程，求出脑组织EB浓度及含量[4]。

1.3统计学分析

选择SPSS18.0软件对实验进行数据统计，湿脑组织中EB含量和脑组织不同再灌注时间缺血区阳性细胞计数等为计量资料，采用均数±标准差表示，不同组大鼠在相同灌注时间差异，采用t检验，同组大鼠不同灌注时间观察指标比较采用方差分析。当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2结果

2.1 BBB通透性改变情况

生理盐水组和中药组湿脑组织中EB含量均明显高于假手术组（P<0.05）。中药组大鼠湿脑组织中EB含量在同一时间点均明显低于生理盐水组（P<0.05）。两组大鼠均灌注1d时，t=2.2425，P=0.0416；灌注3d时，t=2.4607，P=0.0275；灌注7d时，t=2.3811，P=0.0320。生理盐水组内不同灌注时间之间EB含量比较，经过方差分析，差异有统计学意义（F=8.47，P=0.0020）。中药组内不同再灌注时间之间比较差异不明显（P>0.05）。见表1。

表 1 湿脑组织中EB含量（x±s，μg/g）

注：与假手术组比较具有统计学意义（*P <0.05 **P <0.01） ；与同组上一时间点比较具有统计学意义（#P <0.05） ；与同一时间点生理盐水组比较具有统计学意义（△P <0.05 ※※P <0.01）

2.2 VEGF免疫组化染色结果

假手术组未检测出阳性细胞。中药组湿脑组织中VEGF阳性细胞在同一时间点均仅略高于生理盐水组，中药对VEGF蛋白表达无影响（P>0.05）。生理盐水组组内不同灌注时间之间阳性细胞数比较，经过方差分析，差异具有统计学意义（F=965.37，P=0.0000）。生理盐水组内各灌注时间点阳性细胞数与上一时间点比较，灌注3d时，（t=34.7468，P<0.01）、灌注7d时，（t=2.2611，P=0.0402）。均有统计学意义。中药组组内不同灌注时间之间阳性细胞数比较，经过方差分析，差异具有统计学意义（F=1319.07，P=0.0000）。中药组各灌注时间点阳性细胞数与上一时间点比较，灌注3d时（t=40.0840，P<0.01）；灌注7d时（t=2.5310，P=0.0240）均有统计学意义。见表2。

表 2 脑组织不同再灌注时间缺血区免疫组化结果

（x±s，个/高倍视野，×400）

注：与同组上一时间点比较具有统计学意义（#P <0.05）；中药组与同一时间点生理盐水组比较无统计学意义（*P>0.05）

3讨论

脑缺血再灌注是造成缺血性脑血管病一个重要原因[5]。临床上因为患者出现血性脑血管病而引起一系列相应的脑损伤病症如Horner 征等往往是讨论的一项重要课题。有研究报道，脑梗死等缺血性脑部病变患者的病情状况与缺血脑组织中微血管密度程度及其动态变化情况密切相关[6，7]。补肾益气活血则是临床上一种极为常见的治疗方法，其对VEGF的动态变化和BBB通透性影响的研究具有重要意义[8]。

本研究显示，脑缺血再灌注后BBB通透性的改变为一动态变化过程。在缺血再灌注24h时，脑组织中EB含量已明显高于假手术组。当缺血再灌注72h后，脑组织中EB含量已达到峰值，且随着时间推移，其浓度逐渐降低，直至7d时仅稍高于缺血再灌注24h时。血脑屏障的破坏导致脑部出现血管源性水肿，且脑水肿具有明显恶化缺血性脑损伤病情的恶性影响[9]。本研究利用补肾益气活血中药作用大鼠，发现两组大鼠湿脑组织中EB含量均表现为缺血再灌注1d内迅速升高，3d内达到最高值，以后呈减少趋势，且在7d时仍明显高于假手术组。说明补肾益气活血中药通过对血脑屏障功能的改善减轻血管源性脑水肿。有研究表明，VEGF在抗脑缺血损伤中起着刺激损伤部位血管形成、减弱缺血性损伤的重要作用[10，11]。VEGF是一种内皮细胞特异的有丝分裂原，在接受组织中氧含量变化的刺激后可做出应激性反应，调节损伤部位血管增生进而改变供氧量。本研究中，病理切片显色最深部分出现在脑组织缺血损伤坏死区域与正常脑组织交界处，说明此处为低氧区，刺激VEGFR-1和VEGFR-2的表达，促进血管增生、扩张。但是VEGF在改变损伤部位缺血情况的同时也致使损伤部位出现了血浆外渗等情况[12]。中药组大鼠湿脑组织中VEGF阳性细胞在同一时间点均仅微高于生理盐水组，中药在再灌注中VEGF 蛋白的表达没有影响（P>0.05）。中药正是利用对BBB的组织功能，减轻因脑缺血再灌注引起的血管源性脑水肿，进而使肢体功能改善成为可能。

综上所述，中药组大鼠湿脑组织中EB含量在同一时间点均明显低于生理盐水组，证明了脑缺血再灌注损伤后VEGF不能介导血脑屏障破坏，对病变后血管源性脑水肿的发生无明显作用。补肾益气活血中药是通过其改善血脑屏障的功能减轻血管源性脑水肿。

[参考文献]

[1] 周庆萍，陆建锋，王会平，等. 银杏叶提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 浙江大学学报（医学版），2010，39（4）：442-447.

[2] 周文祥，杨永丽，杨晓，等. PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤中的调控作用及重组人红细胞生成素预保护效应[J]. 华中科技大学学报（医学版），2010，39（3）：314-320.

[3] 曾靖，黎晓，黄志华，等. 脑缺血再灌注损伤与炎症反应关系的研究进展[J]. 时珍国医国药，2011，22（3）：698-700.

[4] 陶录岭，刘轲. 中药单体对脑缺血再灌注损伤保护的实验研究进展[J]. 时珍国医国药，2012，23（12）：3107-3109.

[5] 吴常青，汪春彦，邵旭，等. 补阳还五汤有效部位对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制[J]. 中草药，2011，42（1）：114-117.

[6] 杨德森，田先翔，李浩浩，等. 红景天苷对大鼠脑缺血再灌注损伤抗氧化活性的实验研究[J]. 时珍国医国药，2011，22（9）：2288-2290.

[7] 唐婧妹，裴清华. 三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011， 17（15）：210-213.

[8] 殷雁，辛世萌. 丁苯酞预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2012，29（8）：715-718.

[9] 赵玉，包雪鹦. 亚血红素多肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2011，28（8）：721-723.

[10] 倪彩霞，曾南，汤奇，等. 芳香开窍药对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性的影响[J]. 时珍国医国药，2011，22（11）：2639-2640.

[11] 郑超波，江静雯，殷卫海，等. SIRT2对脑缺血再灌注损伤后神经保护作用及机制研究[J]. 中风与神经疾病杂志，2011，28（11）：1002-1006.

[12] 刘斌，蔡梅芝，李爱华，等. 参芎化瘀胶囊对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：229-232.

（收稿日期：2013-11-29）

（x±s，个/高倍视野，×400）

注：与同组上一时间点比较具有统计学意义（#P <0.05）；中药组与同一时间点生理盐水组比较无统计学意义（*P>0.05）

3讨论

脑缺血再灌注是造成缺血性脑血管病一个重要原因[5]。临床上因为患者出现血性脑血管病而引起一系列相应的脑损伤病症如Horner 征等往往是讨论的一项重要课题。有研究报道，脑梗死等缺血性脑部病变患者的病情状况与缺血脑组织中微血管密度程度及其动态变化情况密切相关[6，7]。补肾益气活血则是临床上一种极为常见的治疗方法，其对VEGF的动态变化和BBB通透性影响的研究具有重要意义[8]。

本研究显示，脑缺血再灌注后BBB通透性的改变为一动态变化过程。在缺血再灌注24h时，脑组织中EB含量已明显高于假手术组。当缺血再灌注72h后，脑组织中EB含量已达到峰值，且随着时间推移，其浓度逐渐降低，直至7d时仅稍高于缺血再灌注24h时。血脑屏障的破坏导致脑部出现血管源性水肿，且脑水肿具有明显恶化缺血性脑损伤病情的恶性影响[9]。本研究利用补肾益气活血中药作用大鼠，发现两组大鼠湿脑组织中EB含量均表现为缺血再灌注1d内迅速升高，3d内达到最高值，以后呈减少趋势，且在7d时仍明显高于假手术组。说明补肾益气活血中药通过对血脑屏障功能的改善减轻血管源性脑水肿。有研究表明，VEGF在抗脑缺血损伤中起着刺激损伤部位血管形成、减弱缺血性损伤的重要作用[10，11]。VEGF是一种内皮细胞特异的有丝分裂原，在接受组织中氧含量变化的刺激后可做出应激性反应，调节损伤部位血管增生进而改变供氧量。本研究中，病理切片显色最深部分出现在脑组织缺血损伤坏死区域与正常脑组织交界处，说明此处为低氧区，刺激VEGFR-1和VEGFR-2的表达，促进血管增生、扩张。但是VEGF在改变损伤部位缺血情况的同时也致使损伤部位出现了血浆外渗等情况[12]。中药组大鼠湿脑组织中VEGF阳性细胞在同一时间点均仅微高于生理盐水组，中药在再灌注中VEGF 蛋白的表达没有影响（P>0.05）。中药正是利用对BBB的组织功能，减轻因脑缺血再灌注引起的血管源性脑水肿，进而使肢体功能改善成为可能。

综上所述，中药组大鼠湿脑组织中EB含量在同一时间点均明显低于生理盐水组，证明了脑缺血再灌注损伤后VEGF不能介导血脑屏障破坏，对病变后血管源性脑水肿的发生无明显作用。补肾益气活血中药是通过其改善血脑屏障的功能减轻血管源性脑水肿。

[参考文献]

[1] 周庆萍，陆建锋，王会平，等. 银杏叶提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 浙江大学学报（医学版），2010，39（4）：442-447.

[2] 周文祥，杨永丽，杨晓，等. PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤中的调控作用及重组人红细胞生成素预保护效应[J]. 华中科技大学学报（医学版），2010，39（3）：314-320.

[3] 曾靖，黎晓，黄志华，等. 脑缺血再灌注损伤与炎症反应关系的研究进展[J]. 时珍国医国药，2011，22（3）：698-700.

[4] 陶录岭，刘轲. 中药单体对脑缺血再灌注损伤保护的实验研究进展[J]. 时珍国医国药，2012，23（12）：3107-3109.

[5] 吴常青，汪春彦，邵旭，等. 补阳还五汤有效部位对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制[J]. 中草药，2011，42（1）：114-117.

[6] 杨德森，田先翔，李浩浩，等. 红景天苷对大鼠脑缺血再灌注损伤抗氧化活性的实验研究[J]. 时珍国医国药，2011，22（9）：2288-2290.

[7] 唐婧妹，裴清华. 三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011， 17（15）：210-213.

[8] 殷雁，辛世萌. 丁苯酞预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2012，29（8）：715-718.

[9] 赵玉，包雪鹦. 亚血红素多肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2011，28（8）：721-723.

[10] 倪彩霞，曾南，汤奇，等. 芳香开窍药对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性的影响[J]. 时珍国医国药，2011，22（11）：2639-2640.

[11] 郑超波，江静雯，殷卫海，等. SIRT2对脑缺血再灌注损伤后神经保护作用及机制研究[J]. 中风与神经疾病杂志，2011，28（11）：1002-1006.

[12] 刘斌，蔡梅芝，李爱华，等. 参芎化瘀胶囊对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：229-232.

（收稿日期：2013-11-29）

（x±s，个/高倍视野，×400）

注：与同组上一时间点比较具有统计学意义（#P <0.05）；中药组与同一时间点生理盐水组比较无统计学意义（*P>0.05）

3讨论

脑缺血再灌注是造成缺血性脑血管病一个重要原因[5]。临床上因为患者出现血性脑血管病而引起一系列相应的脑损伤病症如Horner 征等往往是讨论的一项重要课题。有研究报道，脑梗死等缺血性脑部病变患者的病情状况与缺血脑组织中微血管密度程度及其动态变化情况密切相关[6，7]。补肾益气活血则是临床上一种极为常见的治疗方法，其对VEGF的动态变化和BBB通透性影响的研究具有重要意义[8]。

本研究显示，脑缺血再灌注后BBB通透性的改变为一动态变化过程。在缺血再灌注24h时，脑组织中EB含量已明显高于假手术组。当缺血再灌注72h后，脑组织中EB含量已达到峰值，且随着时间推移，其浓度逐渐降低，直至7d时仅稍高于缺血再灌注24h时。血脑屏障的破坏导致脑部出现血管源性水肿，且脑水肿具有明显恶化缺血性脑损伤病情的恶性影响[9]。本研究利用补肾益气活血中药作用大鼠，发现两组大鼠湿脑组织中EB含量均表现为缺血再灌注1d内迅速升高，3d内达到最高值，以后呈减少趋势，且在7d时仍明显高于假手术组。说明补肾益气活血中药通过对血脑屏障功能的改善减轻血管源性脑水肿。有研究表明，VEGF在抗脑缺血损伤中起着刺激损伤部位血管形成、减弱缺血性损伤的重要作用[10，11]。VEGF是一种内皮细胞特异的有丝分裂原，在接受组织中氧含量变化的刺激后可做出应激性反应，调节损伤部位血管增生进而改变供氧量。本研究中，病理切片显色最深部分出现在脑组织缺血损伤坏死区域与正常脑组织交界处，说明此处为低氧区，刺激VEGFR-1和VEGFR-2的表达，促进血管增生、扩张。但是VEGF在改变损伤部位缺血情况的同时也致使损伤部位出现了血浆外渗等情况[12]。中药组大鼠湿脑组织中VEGF阳性细胞在同一时间点均仅微高于生理盐水组，中药在再灌注中VEGF 蛋白的表达没有影响（P>0.05）。中药正是利用对BBB的组织功能，减轻因脑缺血再灌注引起的血管源性脑水肿，进而使肢体功能改善成为可能。

综上所述，中药组大鼠湿脑组织中EB含量在同一时间点均明显低于生理盐水组，证明了脑缺血再灌注损伤后VEGF不能介导血脑屏障破坏，对病变后血管源性脑水肿的发生无明显作用。补肾益气活血中药是通过其改善血脑屏障的功能减轻血管源性脑水肿。

[参考文献]

[1] 周庆萍，陆建锋，王会平，等. 银杏叶提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 浙江大学学报（医学版），2010，39（4）：442-447.

[2] 周文祥，杨永丽，杨晓，等. PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤中的调控作用及重组人红细胞生成素预保护效应[J]. 华中科技大学学报（医学版），2010，39（3）：314-320.

[3] 曾靖，黎晓，黄志华，等. 脑缺血再灌注损伤与炎症反应关系的研究进展[J]. 时珍国医国药，2011，22（3）：698-700.

[4] 陶录岭，刘轲. 中药单体对脑缺血再灌注损伤保护的实验研究进展[J]. 时珍国医国药，2012，23（12）：3107-3109.

[5] 吴常青，汪春彦，邵旭，等. 补阳还五汤有效部位对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制[J]. 中草药，2011，42（1）：114-117.

[6] 杨德森，田先翔，李浩浩，等. 红景天苷对大鼠脑缺血再灌注损伤抗氧化活性的实验研究[J]. 时珍国医国药，2011，22（9）：2288-2290.

[7] 唐婧妹，裴清华. 三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011， 17（15）：210-213.

[8] 殷雁，辛世萌. 丁苯酞预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2012，29（8）：715-718.

[9] 赵玉，包雪鹦. 亚血红素多肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2011，28（8）：721-723.

[10] 倪彩霞，曾南，汤奇，等. 芳香开窍药对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性的影响[J]. 时珍国医国药，2011，22（11）：2639-2640.

[11] 郑超波，江静雯，殷卫海，等. SIRT2对脑缺血再灌注损伤后神经保护作用及机制研究[J]. 中风与神经疾病杂志，2011，28（11）：1002-1006.

[12] 刘斌，蔡梅芝，李爱华，等. 参芎化瘀胶囊对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：229-232.

（收稿日期：2013-11-29）