蚕丝人工肌腱止点转归的观察

刘和风，徐 华，王骏飞，陈东阳，蒋 青

（1.安徽医科大学附属巢湖医院骨二科，安徽 巢湖 238000；2.南京大学医学院附属鼓楼医院关节外科，江苏 南京 210008）

蚕丝人工肌腱止点转归的观察

刘和风1，徐 华2，王骏飞2，陈东阳2，蒋 青2

（1.安徽医科大学附属巢湖医院骨二科，安徽 巢湖 238000；2.南京大学医学院附属鼓楼医院关节外科，江苏 南京 210008）

目的 通过动物实验分析蚕丝人工肌腱止点的生物学过程，评价腱骨愈合与腱腱愈合的生物学转归，进一步研究蚕丝材料在骨科中应用的可行性。方法 在兔胫骨中上1／3处钻孔，实验侧用脱胶的蚕丝，一端穿过骨道固定，另一端与趾长屈肌腱在轻微张力下编织缝合；对照侧以趾长屈肌腱内侧1／3的近断端穿过骨道固定。分别于术后6、12、24周获取标本，行 HE、甲苯胺蓝及Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色，观察蚕丝人工肌腱止点的组织学转归，与对照侧相比，评价蚕丝人工肌腱与骨及腱愈合的生物学转归。结果 蚕丝人工肌腱与骨隧道逐渐形成胶原连接，随着时间延长，愈合越明显，以膜内成骨及软骨内成骨的方式向正常肌腱止点转归的趋势；亦发现Ⅰ型胶原染色随时间延长从少到多，Ⅲ型胶原染色从多到少，具有与对照侧自体肌腱移植相似的改变，但速度较慢。结论 蚕丝人工肌腱可以形成腱骨及腱腱愈合，日后加以改进，有望成为一种新的骨科组织工程人工材料，具有良好的发展前景。

蚕丝；肌腱；组织工程；止点

文献大量报道了组织工程肌腱、韧带的实验研究，但应用于临床的报道甚少。众多学者通过组织工程学方法来研究人工肌腱，探究如何解决临床所面临的肌腱重建问题。研究［1-2］表明：丝素（脱胶的蚕丝）具有良好的机械性能和良好生物相容性，在生物医学领域获得了广泛应用和研究，研究结果表明修饰含精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸三种氨基酸（RGD）的聚合物后蚕丝能促进细胞吸附、增生、分化及促进腱骨愈合的能力。通过我们先前建立蚕丝人工腱止点转归动物模型的方法［3］获取标本进行研究，初步探讨其腱骨愈合及腱腱愈合的生物学转归，探讨蚕丝人工肌腱在骨科组织工程方面的应用前景。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Ⅰ型胶原抗体（Sigma公司），Ⅲ型胶原抗体（Calbiochem公司），鼠两步法检测试剂盒（北京中杉金桥公司）。

1.2 蚕丝制备 用桑蚕丝编织成人工肌腱，0.5%的碳酸钠（Na2CO3）溶液，100℃，30 min，脱胶两次，洗净，干燥。术前预先将人工腱用含 0.4 g丁胺卡那的生理盐水浸泡30 min，备用。

1.3 手术方法 动物模型的建立同我们先前的研究［3］。取新西兰成年大白兔20只，体重2～3 kg，雌雄随机。采取氟哌利多、氯胺酮肌注诱导麻醉后耳缘静脉维持。术区备皮后严格消毒、铺洞巾，以胫骨中上1／3为中心，作前侧一约2 cm纵形切口，切开筋膜、骨膜，以直径2.0 mm克氏针在胫骨中上1／3处钻孔。随机以一侧后肢作实验组，对侧为对照组。实验侧取人工肌腱一端穿过骨道后回转，在轻微张力下以 1号丝线固定于穿过骨道前的蚕丝上，模拟临床人工腱与骨固定要求，另一端与趾长屈肌腱在轻微张力下编织缝合。对照侧分离趾长屈肌腱内侧1／3，在切口远侧切断，近端穿过骨道亦回转，在轻微张力下以1号丝线固定。分层缝合切口。术后当天及第1天，第 2天皆肌注丁胺卡那0.2 g，给予正常活动。术后按6、12、24周各处死大白兔6只并获取标本。

1.4 观察方法 获取标本后，经过修剪并用等渗盐水冲洗、固定24 h以上（10%中性甲醛）、冲洗、脱钙（10%乙二氨四乙酸二钠，EDTANa2）、脱水、包埋成蜡块、切片、染色观察（HE、甲苯胺蓝及Ⅰ、Ⅲ型胶原染色）。

2 结果

2.1 对照侧 术后 6周：肉眼观察肌腱形态良好，有部分黏连，未发现骨道中的移植肌腱组织坏死。HE染色可见移植肌腱内有较多的排列紊乱的成纤维细胞分布，可见骨髓腔开放伴纤维化，在肌腱与骨道处新的骨髓腔逐渐形成。移植物内胶原分布的免疫组织化学染色结果显示：移植肌腱内Ⅰ型胶原在成纤维细胞聚集处和移植物周边分布显著；Ⅲ型胶原的分布情况与Ⅰ型胶原分布结果类似。

术后12周：肉眼观察可见肌腱在骨道处明显的腱骨愈合征，移植肌腱在骨道处形成与正常腱骨止点结构相同的止点结构。染色示移植物中细胞和纤维分布依然紊乱，但出现散在膜内成骨。甲苯胺蓝异染发现骨道出口处较多的软骨内成骨（图1）。免疫组织化学染色可见移植物内Ⅲ型胶原均匀分布，染色较浅。Ⅰ型胶原随纤维排列分布。

图1 对照侧12周甲苯胺蓝染色：×100，纤维软骨（↖）呈异染性，其上方为肌腱及纤维组织，下方为骨组织，为纤维软骨内成骨

术后 24周：可见细胞数量显著减少，移植腱骨止点结构趋向正常并在隧道深部位的肌腱形成骨质（图2），甲苯胺蓝异染发现在新形成的骨髓腔之间仍有部分软骨性组织尚未成为骨质。免疫组织化学染色可见Ⅰ型胶原染色深并均匀分布；Ⅲ型胶原染色浅，分布较不均匀（图3）。

图2 对照侧 24周 HE染色：×100，骨道内腱骨愈合，为膜内成骨，骨化逐渐向肌腱侧推进

2.2 实验侧 术后6周：在软组织和骨道中的蚕丝呈嗜酸性，蚕丝中间部分未见细胞、其他细胞间质及血管浸润，蚕丝周边部分可见肉芽组织、大量成纤维细胞、新生毛细血管、少量巨噬细胞和淋巴细胞浸润，未见嗜酸性粒细胞。免疫组织化学染色结果显示：Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分布同肉芽组织，在成纤维细胞聚集处分布很明显（图4）。

图3 对照侧 24周Ⅲ型胶原免疫组化染色：×100，骨道内膜内成骨

图4 实验侧6周 I型胶原免疫组化染色：×200，蚕丝被 I型胶原和成纤维细胞包埋，左侧蚕丝明显变细（↖），表明部分已被降解

术后12周：在软组织和骨道中的蚕丝中间部分呈嗜酸性，未见细胞、细胞间质及血管浸润；而蚕丝周边部分呈嗜碱性，肉芽组织纤维化明显，蚕丝通过纤维组织形成腱骨及腱腱愈合趋势，但细胞减少，主要为成纤维细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，部分区域纤维软骨化或骨化。甲苯胺蓝染色可见骨道出口处部分包埋蚕丝的纤维组织开始软骨化。免疫组化可见Ⅰ型胶原包绕周边部分的蚕丝，并与骨质及肌腱中Ⅰ型胶原相延续，Ⅲ型胶原染色较浅（图5），分布与Ⅰ型胶原一致。

术后 24周：在软组织和骨道中蚕丝的中间部分呈嗜酸性，未见细胞、细胞间质及血管浸润。骨道蚕丝周边部分呈嗜碱性，未见炎性细胞浸润，被纤维组织包埋，并逐渐软骨化或骨化形成腱骨愈合趋势（图6，7）。在软组织中蚕丝周边部分被纤维组织包绕，亦呈嗜碱性，未见炎性细胞浸润，亦无软骨化、骨化迹象（图8）。甲苯胺蓝染色示在骨道出口处以软骨化的方式形成腱骨愈合。免疫组织化学染色结果显示在蚕丝周边部分 I型胶原分布均匀，排列有序，并与周围骨质或肌腱中 I型胶原相延续，染色较深；Ⅲ型胶原仅局部染色阳性，染色浅。

图5 实验侧12周Ⅲ型胶原免疫组化染色：×100，蚕丝（↙）被Ⅲ型胶原和成纤维细胞包埋，形成较典型的止点：按蚕丝，纤维软骨，软骨钙化，骨质排列

图6 实验侧24周 HE染色：×100，蚕丝被骨质包埋，呈嗜碱性，为膜内成骨，右侧蚕丝（←）已开始降解变细

图7 实验侧24周 HE染色：×100，蚕丝（↙）与骨质形成较典型的止点：按蚕丝，纤维软骨，软骨钙化，骨质排列

3 讨论

自体肌腱存在着供体肌腱的解剖变异、新的创伤、原肌腱处功能受损、自体腱移植后可能有供体组织特异性存在等缺点［4］；同种异体肌腱移植也存在一些缺点：供体来源受限、排斥反应、潜在的传染性疾病感染、移植后远期效果不肯定。随着医学研究的深入，尤其是组织工程兴起，人们逐渐聚焦于人工腱材料的研究。

图8 实验侧24周 HE染色：×100，蚕丝（↘）与肌腱间通过纤维连接

至今国内外大量文献报道了关于蚕丝的研究结果。研究表明：丝素（脱胶的蚕丝）具有良好的机械性能和良好生物相容性，丝素蛋白对细胞有良好的吸附作用，且能促进细胞增生、分化及腱骨愈合的能力［1-2，5］。把多股丝素纤维编织成带，模拟前十字韧带（ACL）的力学特性，在体外加骨髓基质细胞（MSCs）培养发现，蚕丝不仅保持原有的良好机械性能和生物相容性，低降解率，而且促进 MSCs在基质上黏附，分化，增殖，并分泌基质（Ⅰ、Ⅲ型胶原和C型粘蛋白）［6］。本实验证实蚕丝人工腱植入后无明显炎细胞浸润，生物相容性好；可以逐渐被自体肌腱组织代替，并能形成腱骨及腱腱愈合。人工腱中间部分蚕丝仍呈嗜酸性，无明显细胞、血管浸润，与蚕丝编织太紧，无孔隙有关，有待改进。

蚕丝可以作为骨组织形成的支架，Meinel等［7-8］应用蚕丝作为人工材料，以人间充质干细胞为种子细胞，骨形成蛋白（BMP-2）诱导细胞分化，体外构建组织工程骨组织并进行动物试验，获得成功。其后，他们又应用腺病毒转染人间充质干细胞，使其表达BMP-2，并构建人工骨组织也取得了较好的成果［9］。本研究发现蚕丝人工腱与骨隧道逐渐形成纤维连接，随着时间的延长，腱骨愈合越明显，并通过膜内成骨及软骨内成骨的方式向正常肌腱止点转归的趋势。本实验亦发现在腱骨愈合过程中，骨道中主要为膜内成骨，骨道出口处主要为纤维软骨成骨。王健等［10］研究发现：在后交叉韧带重建中，移植物中Ⅰ型胶原含量随时间的推移逐渐升高，移植物中Ⅲ型胶原表现为初期表达浓度低，中期表达浓度高且均匀，后期在局部呈表达浓度亦低。Ⅰ型胶原染色随时间延长从少到多，Ⅲ型胶原染色从多到少，具有与对照侧自体肌腱移植相似的改变，但速度较慢。

本研究表明，蚕丝作为组织工程人工肌腱，有较好的腱骨及腱腱愈合，有形成正常肌腱止点的趋势。日后对蚕丝加以改进，可以成为一种新的骨科组织工程人工材料，应用于人工肌腱、韧带、半月板以及人工骨的研制。

在肌腱韧带重建中，许多支架材料降解速度与新组织形成不匹配。体外实验表明［11］：在生物机械性能方面蚕丝相似于生物肌腱，且丝素具有较低的降解速度和生物相容性良好，1年后其抗张强度大部分下降，2年后在体内的植入位点检测中没有发现异体识别。本实验观察时间有限，最长仅 24周，为不足之处；形成正常肌腱止点的速度较对照组慢，也是需要改进的地方。

随着组织工程理论日益完善，技术不断改进，相信今后对蚕丝进行合理改进，解决种子细胞来源问题，加入适当生长因子，并施以符合条件的组织构建，蚕丝人工腱修复肌腱缺损是一种指日可待的方法，蚕丝人工材料在骨科组织工程方面有着广阔的前景。

［1］ Chen J，Altman GH，Karageorgiou V，et al.Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblast responses on RGD-modified silk fibers［J］.J Biomed Mater Res A，2003，67（2）：559-570.

［2］ Kardestuncer T，Mc Carthy MB，Karageorgiou V，et al.RGD-tethered Silk Substrate Stimulates the Differentiation of Human Tendon Cells［J］.Clin Orthop Relat Res，2006，448：234-239.

［3］ 徐 华，蒋 青，王骏飞，等.蚕丝人工腱止点转归动物模型的建立［J］.中国比较医学杂志，2007，17（5）：285-287，291.

［4］ Kleiner JB，Amiel D，Roux RD，et al.Origin of replacement cells for the anterior cruciate ligament autograft［J］.J Orthop Res，1986，4（4）：466-474.

［5］ Cai K，Yao K，Lin S，et al.Poly（D，L-lactic acid）surfaces modified by silk fibroin：effects on the culture of osteoblast in vitro［J］.Biomaterials，2002，23（4）：1153-1160.

［6］ Altman GH，Horan RL，Lu HH，et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments［J］.Biomaterials，2002，23 （20）：4131-4141.

［7］ Meinel L，Betz O，Fajardo R，et al.Silk based biomaterials to heal critical sized femur defects［J］.Bone，2006，39（4）：922-931.

［8］ Meinel L，Fajardo R，Hofmann S，et al.Silk implants for the healing of critical size bone defects［J］.Bone，2005，37（5）：688-698.

［9］ Meinel L，Hofmann S，Betz O，et al.Osteogenesis by human mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterials：Comparison of adenovirus mediated gene transfer and protein delivery of BMP-2［J］.Biomaterials，2006，27（28）：4993-5002.

［10］王 健，敖英芳.后十字韧带重建后移植物组织学与胶原表型的变化［J］.中华骨科杂志，2006，26（1）：47-50.

［11］Altman GH，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk-based biomaterials［J］.Biomaterials，2003，24（3）：401-416.

Outcome of silk artificial tendon insertion formation

LIU He-Feng1，XU Hua2，WANG Jun-fei2，et al
（1.Department of Orthopedic Surgery，Drum Tower Chaohu Hospital of Anhui Medical University，Chaohu，Anhui 238000，China；2.Nanjing Drum Tower Hospital The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing，Jiangsu 210008，China）

Objective To analyze the biological process of silk artificial tendon by animal experiment and to evaluate the biological outcomes of the healing of tendon to bone and tendon to tendon of silk artificial tendon insertion after implantation，so as to further investigate the feasibility of silk materials application in orthopedics.Methods New Zealand rabbit was treated by drilling in between the upper and middle third of tibia.At the experiment side，one extremity of silk fibers was fixed after threaded through the tibial tunnel，while the other extremity was taken and woven to the flexor digitorum longus muscle tendon；at the control side，the proximal end of one third of flexor digitorum longus muscle tendon was fixed after threaded through the tibial tunnel.The animal was sacrificed to get specimen in 6，12，24 weeks after operation.Standard HE stain，toluidine blue stain and immunohistochemical analysis of type I and III collagens monoclonal antibody were processed to observe histologically the outcome of silk artificial tendon insertion formation.The biological process of the healing of tendon to bone and tendon to tendon of silk artificial tendon insertion after implantation was also evaluated by comparison with the control side.Results The connection of artificial tendon to bone tunnel via collagens was more and more widespread with the gradual emergence of cartilaginous ossification and intramembranous ossification in fibrous tissue，along with time going on.There was a trend of normal tendon insertion formation.Immunohistochemistry result demonstrated that the staining of type I collagen in graft was low at first，then increased gradually；the staining of type III collagen was high at first，then decreased gradually.This change was similar to the control side which was tendon autograft，although slower.Conclusions Silk artificial tendon which has satisfactory consequence in the healing of tendon to bone and tendon to tendon may become a novel tissue engineered material in orthopedics and has good prospects if improved on in the future.

silk；tissue engineering；tendons；insertion

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.021

2013-11-27）

蒋 青，男，教授，博士生导师，研究方向：关节外科，E-mail：jiangqing112＠hotmail.com