吐温80体外溶血研究

贺煜星，丁选胜

（中国药科大学临床药学教研室，江苏 南京 210009）

吐温80体外溶血研究

贺煜星，丁选胜

（中国药科大学临床药学教研室，江苏 南京 210009）

目的 考察吐温80的体外溶血作用，为制剂生产和临床安全用药提供依据。方法 在570 nm波长下，采用紫外分光光度法评价吐温80对家兔红细胞的体外溶血作用。结果 吐温80可引起家兔红细胞体外溶血和红细胞形态改变。结论 吐温80具有一定的体外溶血性。

吐温80；药用辅料；溶血性

吐温80（Tween 80，polyoxyethylene 80）又名聚山梨醇酯80，是一种聚氧乙烯衍生的非离子型表面活性剂，为药物制剂中常用的辅料之一［1］。很多常用中药注射剂有效成分是水难溶性物质，在成型工艺中一般多采用适量吐温80作为增溶剂。近年来，国内外已有吐温80作为增溶性药用辅料引起不良反应的报道［2-4］，普遍认为其存在溶血性［5-6］。本文通过对吐温 80体外溶血规律的研究，为吐温80在注射剂中安全使用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Multiskan_FC酶标仪（Thermo（中国）有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津）；80-2型电动离心机（金坛市金城国胜实验仪器厂）；HH-S型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 实验动物 家兔 6只，雄性，体重 1.8～2.2 kg，普通级，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物生产许可证号：SCXK（苏）2007-0008。

1.3 药品 吐温80（江苏晨牌药业集团股份有限公司，批号130824）；0.9%氯化钠注射液（江苏亚邦生缘药业有限公司，批号1304802）。

2 方法

2.1 红细胞悬液制备 6只家兔均从耳中动脉采血约6 mL，肝素抗凝，加适量0.9%氯化钠注射液1 500 rpm离心15 min，弃去上清液，反复3～4次，至上清液呈无色透明为止。将所得红细胞稀释为5%红细胞悬液，4℃保存，备用。

2.2 供试品溶液配制 精密量取吐温80，用0.9%氯化钠注射液配置成0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%浓度吐温80溶液作为供试品溶液，备用。

2.3 最大吸收波长确定 取 5%红细胞悬液 0.25 mL，加入蒸馏水 1 mL，混匀，于 37℃水浴孵育 30 min后，在200～800 nm波长范围内进行 UV扫描，在570 nm处有最大吸收；同法分别将配置的0.1% ～2%吐温80溶液进行扫描，结果显示，各浓度的吐温80溶液在570 nm波长处均无干扰吸收。

2.4 体外溶血实验 取试管10支，分别编号 1～10号。1～8号管为样品管，分别加入 1 mL 0.1% ～2%吐温80溶液；9号管为阴性对照管，加入1 mL 0.9%氯化钠注射液；10号管为阳性对照管，加入 1 mL蒸馏水。各管分别加入0.25 mL 5%红细胞悬液，摇匀后置37℃水浴锅中孵育。考察孵育 1、3和6 h的溶血情况。孵育后，轻震摇匀，置于光学显微镜下观察红细胞形态。各试管于1 500 rpm离心15 min［7］，取上清液测定吸光度（A），波长 570 nm，光径1 cm。按照公式：溶血率（%）＝（A样-A阴）／（A阳-A阴）×100%计算溶血率，其中A样、A阴和 A阳分别为样品管、阴性对照管和阳性对照管的吸光度。溶血率 ＞5%表明有溶血发生，平行观察6只家兔。

3 结果

3.1 吐温80体外溶血规律 吐温 80溶液可引起家兔红细胞体外溶血，且溶血率呈浓度和时间依赖性。体外孵育3 h和6 h，0.1%吐温80溶液即可引起溶血率大于5%，即引起红细胞溶血。随吐温80溶液浓度增大、孵育时间延长，溶血率呈增高趋势。结果见表1、图1。

表1 孵育1、3、6 h后家兔红细胞溶血率（%，±s，n＝6）

表1 孵育1、3、6 h后家兔红细胞溶血率（%，±s，n＝6）

注：与孵育1 h相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与孵育3 h相比，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

孵育时间吐温80浓度／% 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2 1 h -2.33±0.66 0.03±3.98 6.47±10.5 17.3±17.38 27.00±18.38 40.07±21.80 57.6±21.75 61.26±19.21 3 h 6.31±7.93*＃25.63±14.82**42.07±18.43**56.89±15.94**64.18±15.14**73.42±11.16**80.08±6.41* 84.49±3.40*6 h 14.48±9.03**45.02±15.47**＃74.97±6.78**＃78.58±8.14**＃82.73±7.68**＃86.32±6.22**＃87.51±5.70**＃89.61±3.78**＃

图1 孵育1、3、6 h后家兔红细胞溶血率曲线（%，±s，n＝6）

3.2 吐温80致红细胞形态变化观察 家兔正常红细胞形态呈双面微凹之圆盘状。孵育后，阴性管红细胞形态与孵育前基本一致。低浓度吐温 80溶液可引起红细胞皱缩，并产生棘状红细胞。随浓度升高，可见圆形红细胞、变形红细胞。高浓度吐温 80溶液可致影泡状红细胞产生。结果见图2。

4 讨论

目前，《部颁中药标准》收载的中药注射剂注明添加的增溶剂全部为吐温 80，使用量为 0.1%～2%［8］。实验结果显示，在该浓度范围内，吐温 80可引起家兔红细胞溶血和红细胞形变，且溶血率呈浓度和时间相关性增加。因此，在制剂生产中使用吐温80作为增溶性辅料需注意其溶血性。

吐温 80并非单一结构的纯净物质，而是由多种结构组成的同系混合物［9-10］，因此原料纯度和杂质残留可能与其溶血性相关。同时，吐温 80作为增溶剂，在解决注射剂主要成分水溶性差的同时，有可能成为制剂发生溶血反应的因素之一。因此，深入进行吐温80的溶血性研究，有助于建立其质量控制标准，在有效增溶的同时提高安全性，为中药注射剂中吐温80的合理使用提供依据。吐温80的体内溶血过程与机制、药物与辅料的相互作用等尚待进一步研究。

图2 吐温80孵育1、3、6 h后家兔红细胞形态变化（光镜，40×10）

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［5］ 郭 琰，李贻奎，吴翠萍，等.6种不同来源的注射用聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯致敏性和溶血性实验研究［J］.中国中药杂志，2011，36（14）：1879-1883.

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［9］ U.S.Pharmacopeial Convention.United States Pharmacopeia［M］.34 ed.2011：1634-1636.

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Study on the hemolysis of Tween 80 in vitro

HE Yu-xing，DING Xuan-sheng （Department of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 210009，China）

Objective To investigate the hemolysis of tween 80 in vitro，providing the basis for preparation of production and safety of clinical medication.Methods To evaluate the hemolysis of tween 80 in vitro on rabbit erythrocytes by UV spectrophotometry at 570nm wave length.Results Tween 80 could cause hemolysis and morphological changes of rabbit erythrocytes in vitro.Conclusion Tween 80 can cause hemolysis in vitro.

Tween 80；pharmaceutical excipients；hemolysis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.011

2014-01-05，

2014-01-28）

贺煜星，女，硕士研究生

丁选胜，男，副教授，硕士生导师，研究方向：临床药学，E-mail：dxs0162＠sina.com