椭圆形骨道改良重建兔前交叉韧带动物模型的建立

赵逢源 史尉利 张继英 任博 张辛 胡晓青 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100191）

北京市运动医学关节伤病重点实验室（北京 100191）

椭圆形骨道改良重建兔前交叉韧带动物模型的建立

赵逢源 史尉利 张继英 任博 张辛 胡晓青 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100191）

北京市运动医学关节伤病重点实验室（北京 100191）

目的：解剖研究兔前交叉韧带止点的大体形态，建立椭圆形骨道改良重建兔前交叉韧带动物模型。方法：18只新西兰大白兔（2.5～3kg），8只用于前交叉韧带止点解剖研究，10只用于椭圆形骨道动物模型的建立。去除兔膝关节股骨内髁和前交叉韧带周围软组织，观察兔前交叉韧带股骨和胫骨止点形态，并使用游标卡尺对止点长短径进行测量。制作椭圆形骨道扩孔器（截面1.6mm×2.5mm），对10只新西兰大白兔右腿行椭圆形骨道重建前交叉韧带作为椭圆形骨道组，对其左腿用传统方法圆形骨道（截面直径2mm）重建前交叉韧带作为圆形骨道组。取兔自体半腱肌放入骨道并固定，观察移植物与骨道的匹配程度。术后立即对兔双侧膝关节行三维CT扫描，对股骨和胫骨骨道的截面积、长径、短径、直径进行测量。结果：兔前交叉韧带止点的解剖形态为椭圆形。股骨止点的长径为5.28±0.83mm，短径为2.61± 0.33mm。胫骨止点长径为5.33±0.40mm，短径为2.68±0.11mm。移植物肌腱与骨道匹配良好，未见明显空隙。椭圆形骨道组股骨骨道截面积为3.18±0.09mm2，胫骨骨道截面积为3.26±0.15mm2。圆形骨道组股骨骨道截面积为3.13±0.10mm2，胫骨骨道截面积为3.11±0.11mm2。椭圆形骨道组和圆形骨道组之间骨道截面积无显著差异。结论：兔前交叉韧带止点为椭圆形。使用自制椭圆形骨道扩孔器可成功构建与圆形骨道相对应的兔椭圆形骨道动物模型，并有很好的移植物与骨道匹配性，为下一步深入研究奠定了实验动物模型基础。

椭圆形骨道；前交叉韧带；重建；动物模型；解剖

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤是一种多发而又严重的运动损伤。目前，关节镜下ACL重建术是治疗ACL断裂的主要手术方式。每年美国要进行20万例ACL重建术，全球每年有超过40万例ACL重建术[1-3]。随着对疾病认识的加深和经济社会的不断发展，近些年来我国ACL重建术逐年增加。

ACL重建的目的是恢复膝关节的解剖和生物稳定性，这对于延缓骨关节炎的发生具有重要意义[4]。随着ACL止点解剖研究的发展，学者们认识到ACL的非解剖重建是手术失败的最重要原因[1]。

近年来解剖研究认为ACL无法自然分为前内束和后外束，由完整一束构成[5]。ACL股骨止点为椭圆形[6]，胫骨止点为鸭脚形或椭圆形[7]。ACL由中心束和扇形纤维构成[6，8]，形成两端止点宽大中段狭长的“沙漏”样结构，这种结构对于缓解韧带止点应力具有重要意义。

解剖单束重建ACL是目前ACL重建研究的一个热点。使重建ACL止点和原始止点解剖形态相一致可以取得更好的生物力学效果。Petersen等学者对于椭圆形骨道重建ACL进行了初步探索，认为椭圆形骨道重建ACL可以取得良好的临床效果[9-11]。

然而，目前尚缺乏关于椭圆形骨道重建ACL的组织学、生物力学、影像学相关研究。因此，构建椭圆形骨道重建ACL动物模型对于椭圆形骨道的深入研究具有重要意义。本研究通过自制椭圆形骨道扩孔器制作骨道，构建了兔椭圆形骨道重建ACL动物模型，并进行骨道影像学测量观察对比研究，为下一步深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 兔ACL止点形态研究

8只成年新西兰大白兔，体重2.5～3kg，由北京大学医学部动物部提供。每只动物取左侧下肢，去除肌肉等软组织暴露膝关节。使用摆锯去除股骨内髁，使用眼科剪去除后交叉韧带、侧副韧带、半月板、跳跃韧带和粘膜韧带等结构，暴露ACL股骨止点和胫骨止点。使用标记笔对兔ACL股骨止点和胫骨止点范围进行标定。从ACL股骨止点和胫骨止点处剪断韧带，观察兔ACL止点形态。使用游标卡尺测量兔ACL止点长径和短径。见图1。

图1 兔ACL止点解剖

1.2 椭圆形骨道改良重建兔前交叉韧带动物模型研究

1.2.1 实验动物分组

10只成年新西兰大白兔，体重2.5～3kg，由北京大学医学部动物部提供。每只动物右膝关节行椭圆形骨道重建ACL作为椭圆形骨道组，左膝关节行圆形骨道重建ACL作为圆形骨道组。

1.2.2 椭圆形扩孔器的制作

依据椭圆形面积计算公式S=π（圆周率）×A×B/4（A、B分别是椭圆的长轴、短轴的长），以及圆形面积计算公式S=π×（D/2）2（D表示直径）。如果椭圆形面积和圆形面积相等，则A×B=D×D。圆形骨道组拟定钻直径2mm的圆形，则椭圆形骨道组相对应的面积相等的椭圆可以为1.6mm×2.5mm。制作一横截面积为1.6mm×2.5mm的椭圆形骨道扩孔器，深圳市华美天创金属材料有限公司提供。扩孔器含直径1.4mm圆形空心结构，可插入直径1.2mm克氏针，指导扩孔器方向和定位。扩孔器头端为一尖端结构，便于穿破骨皮质。见图2。

图2 椭圆形骨道扩孔器

1.2.3 动物模型的建立（图 3）

手术步骤具体如下：采用耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 ml/kg）对动物进行全身麻醉，无菌条件下行右膝内侧髌骨旁切口逐层分离打开关节腔，将髌骨向外脱出暴露ACL。使用眼科剪分别于股骨止点和胫骨止点剪断ACL，并将离体ACL组织去除，查前抽屉试验阳性。使用直径1.2mm克氏针钻入ACL股骨止点中心区域并穿破对侧骨皮质。将椭圆形骨道扩孔器沿克氏针扎入ACL止点，调整扩孔器方向。使用小骨锤敲击骨道扩孔器，逐渐突破对侧骨皮质，拔出克氏针和扩孔器。采用相同方法制备胫骨骨道，同样首先由内向外钻入直径1.2mm克氏针，然后使用扩孔器将骨道扩为相对应的椭圆形。沿内侧副韧带后缘和膝关节交点做一小切口，暴露半腱肌，利用眼科剪完整取出半腱肌。使用涤纶3-0血管缝线（上海医用缝合针厂有限公司）编织缝入半腱肌两端，作为牵引线。通过自制过腱器将移植物放入股骨骨道和胫骨骨道，屈膝30°位骨桥法固定ACL于股骨和胫骨。观察移植物与骨道匹配情况，二者之间是否存在明显缝隙。使用直径0.8mm探针尝试插入移植物与骨道之间的缝隙，作为判断移植物与骨道匹配程度的标准。生理盐水冲洗关节腔，将髌骨复位，查前抽屉试验阴性，逐层缝合关节腔和皮肤。左膝行圆形骨道重建ACL，相同方法暴露ACL并切断，使用直径2mm的克氏针由内向外分别钻股骨骨道和胫骨骨道。相同方法取半腱肌、过腱并固定肌腱于两端，同样方法判断移植物与骨道的匹配性，生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合。为防止术后关节感染，术后给予每只动物肌注青霉素40万单位，连续3天。分笼饲养，自由活动。

图3 兔椭圆形骨道模型建立

1.2.4 膝关节CT检查

术后在麻醉状态下立即对实验动物行双膝关节（左右膝分别检查）三维CT扫描，于西门子Definition Flush二代双源CT检测（德国西门子公司）。放射参数：管电压120 kv，100 mA×s，使用骨算法，层间距0.4mm，层厚0.6mm。

1.2.5 骨道数据测量

两位运动医学医师和一位放射科医师分别对椭圆形骨道组和圆形骨道组骨道横截面积和直径进行分析。使用AW Volumeshare 4软件（美国通用公司）对骨道数据进行测量。首先建立与骨道长径相垂直的平面，其次由骨道口向外逐渐移动，测量第一个出现的完整截面的数据。见图4。

图4 骨道测量

1.2.6 术后 4周大体观察

术后4周使用过量麻醉方法处死实验动物。沿髌骨内侧旁切口入路逐层切开，暴露膝关节，观察椭圆形骨道组和圆形骨道组移植物大体形态。使用摆锯去除股骨内髁，观察移植物肌腱与骨道壁形成的新止点。

1.3 统计学分析

计量资料采用均数±标准差来表示，采用SPSS22.0软件进行统计学分析，数据符合正态分布（KS值和SW值大于0.05），两组均数比较采用配对t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 兔ACL止点形态及几何测量

兔ACL股骨止点和胫骨止点都为椭圆形，止点纤维较宽大，中段较狭窄。见图1。股骨止点的长径为5.28±0.83mm，短径为2.61±0.33mm，长短径间差异具有统计学意义（P=0.004）。胫骨止点长径为5.33±0.40mm，短径为2.68±0.11mm，长短径间差异具有统计学意义（P=0.001）。见表1。

表1 兔ACL止点解剖数据（单位：mm）

2.2 术中移植物与骨道周边匹配情况观察

椭圆形骨道组移植物在骨道口处呈扁条带形，与骨道匹配良好，未见明显缝隙，探针难以插入骨道内。圆形骨道组移植物在骨道口处呈圆柱体形，与骨道匹配良好，未见明显缝隙，探针难以插入骨道内。见图5。

图5 移植物骨道匹配情况观察

2.3 椭圆形骨道截面积和长短径测量

椭圆形骨道组股骨骨道截面积为3.18±0.09mm2，长径为2.46±0.09mm，短径为1.62±0.07mm。胫骨骨道截面积为3.26±0.15mm2，长径为2.50±0.08mm，短径为1.63±0.10mm。见表2。

表2 椭圆形骨道组截面测量数据

2.4 圆形骨道截面积和直径测量

圆形骨道组股骨骨道截面积为3.13±0.10mm2，直径为1.99±0.05mm。胫骨骨道截面积为3.11± 0.11mm2，直径为1.99±0.07mm。见表3。

表3 圆形骨道组截面测量数据

2.5 椭圆形骨道和圆形骨道截面积

椭圆形骨道组和圆形骨道组股骨骨道截面积分别是3.18±0.09mm2和3.133±0.10mm2，P=0.446，差异无统计学意义。椭圆形骨道组和圆形骨道组胫骨骨道截面积分别是3.26± 0.15mm2和3.11± 0.11mm2，P=0.056，差异无统计学意义。见图6。

图6 骨道截面积对比

2.6 股骨骨道截面积和胫骨骨道截面积

椭圆形骨道组股骨骨道和胫骨骨道截面积分别是3.18±0.09mm2和3.26±0.15mm2，P=0.030，差异具有统计学意义。圆形骨道组股骨骨道和胫骨骨道截面积分别是3.13±0.10mm2和3.11±0.11mm2，P= 0.587，差异无统计学意义。见图6。

2.7 术后 4周大体观

ACL重建术后4周，椭圆形骨道组和圆形骨道组移植物仍位于关节内，韧带张力良好，查前抽屉试验阴性。去除股骨内髁后可见移植物肌腱与骨道壁已形成新的止点相连接，椭圆形骨道组移植物与骨道壁之间无缝隙，移植物与骨道匹配良好。见图7。

图7 椭圆形骨道组4周大体观

3 讨论

3.1 兔ACL止点解剖形态的研究

近年来ACL解剖研究认为ACL由整体一束构成，无法自然分为前内束和后外束，解剖单束重建ACL成为研究热点[5]。王健全等对30例膝关节标本解剖研究，得到ACL股骨止点长径为19.32±2.42mm，短径为10.52±2.24mm，人ACL股骨止点为椭圆形[12]。Fu等对100例病人关节镜下ACL胫骨止点进行了测量和几何分型，结果显示，人ACL胫骨止点的长径是16.1±2.6mm，短径是9.6±1.5mm，ACL胫骨止点为椭圆形、三角形或“C”形[13]。

兔膝关节解剖结构与人的相近，且大小适中，已广泛用于膝关节软骨、半月板、韧带研究的动物模型[14-16]。Nikolaou解剖研究了兔ACL胫骨止点，认为兔ACL胫骨止点是宽大的，不是圆形[17]。然而作者并没有测量ACL止点长径和短径，且对兔ACL止点形态无详细描述。刘平等对兔ACL进行了解剖研究，认为兔ACL上端最细，向下逐渐增粗，扇形止于胫骨[18]。本研究对8例兔膝关节ACL止点进行解剖研究和测量，与人相类似，兔ACL股骨和胫骨止点也是椭圆形，长径约为短径长度的2倍，长径与短径差异具有统计学意义。因此，选择兔作为椭圆形骨道重建ACL模型具有解剖学基础。

3.2 椭圆形骨道动物模型的建立

传统单束重建ACL的骨道截面为圆形，无法模拟ACL椭圆形解剖形态。Noh通过并排钻两个相交的圆形骨道的方法，近似构建了一椭圆形骨道，并对患者进行了两年的随访观察，结果显示，椭圆形骨道组患者术后Lysholm评分较圆形骨道组高，差异具有统计学意义[10]。然而目前尚未见关于椭圆形骨道重建ACL的组织学、生物力学和影像学研究。目前对于椭圆形骨道对ACL重建影响的研究尚处于初始阶段。动物模型的建立对于进一步研究椭圆形骨道对ACL重建后组织学、生物力学和影像学影响具有重要意义。

综合考虑兔半腱肌截面大小和ACL止点大小，本研究选择直径2mm圆形骨道作为对照组[19，20]。依照面积相等原则，则椭圆形骨道组截面为1.6mm×2.5mm。由于兔ACL止点范围狭小，很难使用骨钻精确构造椭圆形骨道。故制作椭圆形骨道扩孔器，采用扩孔法完成椭圆形骨道的制备。术中观察椭圆形骨道组与圆形骨道组移植物与骨道的匹配情况，两组均未见明显缝隙，说明移植物与骨道匹配良好。椭圆形骨道组移植物肌腱在骨道口处呈扁条带形，更符合兔ACL止点解剖形态。

术后三维CT测量的椭圆形骨道组骨道数据以及圆形骨道组骨道数据较理论值存在差异。原因可能是：（1）使用骨钻钻取圆形骨道时存在操作手微小晃动可能，造成骨道形态发生微小改变；（2）使用椭圆形骨道扩孔器扩孔过程中，骨道在敲击力的作用下发生膨胀扩大；（3）使用软件在CT上测量骨道截面时，存在误差可能。

术后三维CT测量骨道截面积，结果显示椭圆形与圆形骨道组骨道截面积基本相同，骨道径线存在差异。这表明椭圆形骨道组较圆形骨道组截面形态发生了变化，但面积匹配良好。椭圆形骨道组骨道截面较圆形骨道组稍大（差异无统计学意义），原因可能是使用扩孔器扩骨道时发生骨道壁膨胀扩大。然而椭圆形骨道组较圆形骨道组骨道截面积无统计学差异，且无骨道壁打爆的发生。这表明使用扩孔法将一个小圆扩成相应的椭圆形骨道的方法安全有效。椭圆形骨道动物模型造模成功。

椭圆形骨道组胫骨骨道截面积较股骨骨道大，具有统计学差异（P=0.03），可能原因是胫骨骨道较股骨骨道长，在使用扩孔器扩骨道时更容易发生骨道壁膨胀扩大。且胫骨骨道壁骨密度较股骨骨道壁差[21]，这也更易发生骨道壁扩大。

ACL重建4周后椭圆形骨道组移植物形态良好，前抽屉试验阴性，较圆形骨道组无明显差异，表明动物模型是可靠的。去除股骨内髁后可见移植物肌腱与骨道壁已形成新的止点，无明显缝隙，说明移植物与骨道之间匹配良好。

3.3 本实验的局限性

兔ACL止点面积较小，使用游标卡尺目测测量存在误差可能，若使用精度更高的方法会更精确。

4 结论

兔ACL股骨和胫骨止点为椭圆形；通过制作椭圆形骨道扩孔器，使用扩孔法可以构建与圆形骨道相对应的椭圆形骨道动物模型，并有很好的移植物与骨道匹配性，表明椭圆形骨道重建ACL动物模型可行，为下一步深入研究奠定了实验动物模型基础。

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A Novel Animal Model for Anterior Cruciate Ligament Reconstruction Using Oval Tunnels

Zhao Fengyuan，Shi Weili，Zhang Jiying，Ren Bo，Zhang Xin，Hu Xiaoqing，Ao Yingfang
Institute of Sports Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China
Beijing Key Laboratory of Sports Injuries，Beijing 100191，China

Ao Yingfang，Email：yingfang.ao@vip.sina.com

ObjectiveTo study the general shape of anterior cruciate ligament(ACL)insertion in rab⁃bits and establish an animal model of ACL reconstruction using oval tunnels.MethodsEighteen mature white New Zealand rabbits were used in this study.Eight of them were used for anatomy study and the other 10 were for building an animal model.After removal of the medial femoral condyle and oth⁃er soft tissues around ACL，the morphology of the ACL insertion was examined and the diameter of ACL insertions was measured using a caliper.An oval-tunnel dilator(1.6mm×2.5mm)was designed to make an oval-tunnel in the right knee of the rabbits while a round tunnel was drilled using a 2mm diameter Kirschner wire in the left knee of the rabbits.Their hamstring tendon grafts were har⁃vested as grafts for both sides and the compatibility between the bone tunnel and graft was examined for both groups.Right after the surgery，the knees of both sides were given the three-dimensional CT scan.ResultsThe shape of ACL insertion of rabbits was oval.In the femur side，the average major andminor diameter of the ACL insertion was 5.28±0.83mm and 2.61±0.33mm respectively.In the tibial side，the major and the minor diameter of the ACL insertion was 5.33±0.40mm and 2.68± 0.11mm.The bone tunnel was compatible with the graft in both groups.In the oval tunnel ACL recon⁃struction group，the cross sectional area of the femoral bone tunnel was 3.18± 0.09mm2and the cross sectional area of the tibial bone tunnel was 3.26±0.15mm2.In the round tunnel ACL recon⁃struction group，the corresponding measurements were 3.13±0.10mm2and 3.11±0.11mm2respective⁃ly.There was no significant difference between the two groups.Conclusion The shape of ACL inser⁃tion in rabbits is oval.Using the self-made oval tunnel dilator we have successfully built an oval tun⁃nel ACL reconstruction animal model with a good compatibility between the bone tunnel and graft. This lays the foundation for further research in the future.

oval tunnel，anterior cruciate ligament，reconstruction，animal model，anatomy

2017.02.09

北京市科技新星计划[项目编号：xx2014003（A）]

第1作者：赵逢源，Email：mickeyzhaofy@163.com；

：敖英芳，Email：yingfang.ao@vip.sina.com