不同抗性黄瓜砧木对南方根结线虫侵染的生理生化反应

王艳艳,魏珉,2*,沈琼,李岩,2,史庆华,2

不同抗性黄瓜砧木对南方根结线虫侵染的生理生化反应

王艳艳1,魏珉1,2*,沈琼1,李岩1,2,史庆华1,2

1.山东农业大学园艺科学与工程学院,山东泰安271018
2.农业部黄淮海设施农业工程科学观测试验站,山东泰安271018

嫁接是提高黄瓜对根结线虫抗性的有效手段。本试验以对南方根结线虫抗性不同的黄瓜嫁接砧木‘云南黑籽南瓜'（低感）和‘甜砧'（高感），以及‘新泰密刺'黄瓜为试材，采用人工接种方法，比较研究了线虫侵染后三者的生理生化反应。结果表明，根结线虫侵染后，三者的叶片和根系中活性氧代谢、苯丙烷类代谢和病程相关蛋白活性均升高；在整个侵染过程中，超氧阴离子生成速率、过氧化氢含量、总酚含量和苯丙氨酸解氨酶等其他相关酶活性均先增高后降低，而木质素含量缓慢升高；三份材料中，以低感砧木‘云南黑籽南瓜'的物质含量和酶活性水平最高，升高幅度也最大。

黄瓜;砧木;南方根结线虫;生理生化反应

随着设施栽培年限的增加，根结线虫对黄瓜的危害逐年加重，严重时甚至绝收[1]。由于目前尚未发现抗根结线虫的黄瓜栽培种，因此生产中常采用嫁接的方法来提高抗性[2]。植物的抗病性是形态结构和生理生化等诸多因素综合作用的结果，抗病的物质基础包括木质素、植保素、活性氧、病程相关蛋白、水杨酸等[3]。苯丙烷代谢途径可产生植保素、木质素和酚类等次生物质，是植物抗病性增强的重要机制之一[4]。当植物遭受病原菌侵染时，体内活性氧代谢加快，被认为是植物抗病的最早期反应之一[3,5]。病程相关蛋白是植物在病理或病理相关环境下诱导产生的一类可以直接攻击病原菌的蛋白，主要活性蛋白包括几丁质酶(CHT)、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)、β-1,3-1,4-葡聚糖酶、脱乙酰几丁酶、过氧化物酶、类甜味蛋白、α-淀粉酶和溶菌酶等[6,7]。

本试验以对南方根结线虫抗性不同的南瓜砧木以及黄瓜为试材，研究根结线虫侵染后其根系和叶片中的活性氧代谢、苯丙烷类代谢特征变化以及病程相关蛋白活性变化，探讨不同抗性砧木和黄瓜对南方根结线虫侵染后的生理生化反应差异，以期为揭示黄瓜嫁接抗根结线虫机制以及为抗线虫砧木品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料来源

供试材料为对南方根结线虫低感砧木‘云南黑籽南瓜'、高感砧木‘甜砧'，以及黄瓜品种‘新泰密刺'。

南方根结线虫二龄幼虫（J2）采用刘维志[8]的方法从黄瓜感染根结线虫病株中提取，制备二龄幼虫悬浮液，浓度1000条/mL。

1.2试验的处理

试验于2012年3-6月在山东农业大学园艺实验站日光温室内进行。3月20日浸种催芽，3月22日选取发芽种子播种于直径17 cm×高15 cm硬质塑料钵中，每品种30钵，每钵两株，钵内装高温灭菌基质（砂:土壤=1:2），并掺混少量草炭。4月15日，幼苗两叶一心时每品种选15钵，采用根际打孔法[9]接种南方根结线虫，每株接种4000条（每钵接种8000条），另外15钵以接等量清水作对照。接种后常规管理。

1.3测定指标与方法

分别于接种8、16、24、32和40 d后取样，每次每品种取3钵，清洗根系和叶片，用吸水纸擦干，去除叶脉，剪碎混匀，用液氮罐带回实验室进行生理生化指标测定。

超氧阴离子（O2-·）生成速率和过氧化氢（H2O2）含量测定参照张治安和陈展宇[10]方法；苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性测定参照郑炳松[11]方法；木质素含量测定参照Sancho等[12]方法；总酚含量测定参照林值芳等[13]方法；几丁质酶（CHT）活性测定参照Boller等[14]方法；β-1,3-葡聚糖酶（GLU）活性测定参照Miller[15]方法；过氧化物酶（POD）活性测定参照张治安和陈展宇[10]方法。

1.4数据分析与处理

采用Excel 2010进行数据处理，采用DPS软件对数据进行方差分析及最小显著差异性检验（Duncan's新复极差法，P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1黄瓜和砧木根系及叶片中活性氧代谢变化

图1 黄瓜和砧木根系及叶片中超氧阴离子生成速率变化Fig.1 The changes of O2-·generation rate in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.1.1 O2-·生成速率从图1可以看出，未接种南方根结线虫的处理，根系和叶片中O2-·生成速率均较低，且三者差异不显著。接种根结线虫后，根系与叶片中O2-·生成速率升高，以‘云南黑籽南瓜'的O2-·生成速率最大，其次是‘甜砧'，黄瓜最小。根系中O2-·生成速率，均在接种8 d后达到最大值，‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和黄瓜分别较未接种对照增加116.59%、85.40%和84.10%；然后逐渐下降，24 d和32 d后与未接种对照无显著差异，但40 d后O2-·生成速率显著升高。线虫侵染过程中，叶片O2-·生成速率始终高于未接种对照，在接种16 d后达到最大，随后下降，40 d时略有回升，但增幅小于根系。

2.1.2 H2O2含量从图2可以看出，未接种南方根结线虫处理，‘云南黑籽南瓜'和‘甜砧'根系中H2O2含量高于黄瓜，而叶片中H2O2含量无显著差异。接种线虫后，根系与叶片中H2O2含量均升高，以‘云南黑籽南瓜'H2O2含量最高，‘甜砧'次之，黄瓜最小。根系中H2O2含量在接种8 d后达到最大值，此时黄瓜、‘甜砧'和‘云南黑籽南瓜'分别较未接种对照增加27.45%、32.43%和47.39%，随后逐渐降低，接种40 d后H2O2含量又明显升高。叶片中H2O2含量于接种16 d后达到最大值，40 d后也有再次回升。

图2 黄瓜和砧木根系及叶片中过氧化氢含量变化Fig.2 The changes of H2O2content in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.2黄瓜和砧木根系及叶片中苯丙烷类代谢特征变化

2.2.1 PAL活性从图3可以看出，未接种南方根结线虫的3个品种，根系和叶片中PAL活性均较低，‘云南黑籽南瓜'和‘甜砧'差异不显著，但都高于黄瓜。接种根结线虫后，根系和叶片中PAL活性均升高，以‘云南黑籽南瓜'的PAL活性最大，其次是‘甜砧'，黄瓜最小。根系PAL活性，黄瓜于接种8 d后达最大值，此时较未接种对照增加23.68%；‘甜砧'和‘云南黑籽南瓜'分别于接种16 d后达最大值，此时分别较未接种对照增加28.05%和37.31%；三者PAL活性均于接种40 d后回升。叶片PAL活性在接种24 d后达到最大值，然后下降，40 d后稍有回升，其增幅小于根系。

图3 黄瓜和砧木根系及叶片中PAL活性变化Fig.3 The changes of PALactivity in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.2.2 PPO活性从图4可以看出，未接种根结线虫的3个试材，根系和叶片中PPO活性均较低，彼此间差异很小。接种根结线虫后，PPO活性升高，以‘云南黑籽南瓜'的PPO活性最大，其次是‘甜砧'，黄瓜最小。根系PAL活性于接种16 d后达最大值，‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和黄瓜分别较未接种对照增加99.08%、77.73%和56.49%，然后开始降低，三者均于接种40 d后略有回升。叶片中PAL活性在接种24 d后达到最大值，然后下降，40 d后出现小幅回升。

图4 黄瓜和砧木根系及叶片中PPO活性变化Fig.4 The changes of PPO activity in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.2.3 总酚含量从图5可以看出，未接种根结线虫的3个试材，根系和叶片中总酚含量均较低，彼此间差异较小。根结线虫侵染导致根系与叶片中总酚含量升高，以‘云南黑籽南瓜'的总酚含量最大，平均比‘甜砧'和黄瓜的根系和叶片高出8.45%、15.11%和4.24%和6.91%。根系中总酚含量在接种8 d后达到最大值，此时‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和黄瓜分别较未接种对照增加46.84%、34.00%和30.36%，然后下降；三品种叶片中总酚含量均在接种24 d后达到最大值，然后下降；接种40 d后，根系和叶片中总酚含量均略有回升。

图5 黄瓜和砧木根系及叶片中总酚含量变化Fig.5 The changes of total phenolic content in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.2.4 木质素含量如图6所示，未接种根结线虫的3个试材，根系中木质素含量以‘云南黑籽南瓜'和‘甜砧'较高，比‘新泰密刺'黄瓜平均增加11.77%和6.85%，叶片中木质素含量差异较小。接种线虫引起根系和叶片中木质素含量均增加，且在整个侵染过程中一直呈上升趋势，‘云南黑籽南瓜'木质素含量最大，‘甜砧'次之，黄瓜最小。接种40 d后，‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'、‘新泰密刺'黄瓜根系和叶片中木质素含量分别比未接种对照增加21.94%、18.75%、16.04%和17.63%、11.68%、10.00%。

图6 黄瓜和砧木根系及叶片中木质素含量变化Fig.6 The changes of lignin content in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.3黄瓜和砧木根系和叶片中病程相关酶活性变化

2.3.1 CHT活性如图7所示，未接种南方根结线虫时，3个试材根系与叶片中CHT活性均较低，且彼此间差异较小。接种南方根结线虫导致根系及叶片中CHT活性均升高。根系中CHT活性在接种8 d后达到最大值，此时‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和黄瓜分别较未接种对照增加46.25%、36.7%和28.48%。叶片中CHT活性在接种16 d后达最大值，此时‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和黄瓜分别较未接种对照增加11.78%、7.93%和5.68%，然后降低，后期三个试材之间以及与未接种对照之间比较差异不显著。

图7 黄瓜和砧木根系及叶片中几丁质酶活性变化Fig.7 The changes of CHT activity in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.3.2 GLU活性如图8所示，未接种南方根结线虫的3个试材，根系与叶片中GLU活性均较低，但不同材料比较以‘云南黑籽南瓜'的GLU活性最强。接种根结线虫后，根系与叶片中GLU活性均显著升高，同样以‘云南黑籽南瓜'GLU活性最大，黄瓜最小。根系中GLU活性均在接种8 d后达到最大值，此时‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和黄瓜分别较未接种对照增加77.35%、46.29%和32.42%，接种40 d后时活性再次升高。随着根结线虫侵染，叶片GLU活性缓慢上升，并在接种24 d后达最大值，然后持续下降。

图8 黄瓜和砧木根系及叶片中β-1,3-葡聚糖酶活性变化Fig.8 The changes of GLU activity in roots and leaves of cucumber and rootstocks

2.3.3 POD活性如图9所示，未接种南方根结线虫时，3份材料的根系中POD活性以‘云南黑籽南瓜'最强，与‘甜砧'差异不显著，但明显高于黄瓜；叶片中POD活性彼此间差异不显著。接种根结线虫后，根系与叶片中POD活性均显著升高，以‘云南黑籽南瓜'的POD活性最大，其次是‘甜砧'，黄瓜最小。黄瓜根系中POD活性在接种8 d后达最大值，较对照增幅29.01%，而‘甜砧'和‘云南黑籽南瓜'在接种16 d后达最大值，此时分别较未接种对照增加30.39%和37.11%，然后降低，接种40 d后再次大幅度上升；叶片中POD活性于接种24 d后达到最大值，然后持续降低，接种40 d后没有二次升高现象。

3 讨论与结论

3.1不同抗性砧木和黄瓜感染南方根结线虫后活性氧代谢差异

植物在正常生长条件下，体内活性氧的产生与清除维持动态平衡。当受到外界胁迫时，体内会产生大量活性氧，破坏细胞膜[16]。根结线虫侵染会引起植物体内活性氧代谢水平的改变。叶德友等[17]研究表明，接种根结线虫后，黄瓜感病品种‘津春4号'活性氧升高幅度大于抗病品种‘西印度瓜'，并认为是由于活性氧升高破坏了细胞膜系统。而徐小明等[18]研究则发现，根结线虫侵染后，茄子抗病砧木‘托鲁巴姆'根系中活性氧升高幅度显著大于感病品种‘赤茄'，抗线虫能力与根系活性氧代谢水平呈正相关，贾双双[19]在番茄砧木抗线虫能力的研究中也得到了相似的结论。本试验结果表明，根结线虫侵染后，无论根系还是叶片中，三个材料的活性氧水平均显著升高，低感品种‘云南黑籽南瓜'升幅最大、活性氧水平最高。上述结果说明，根结线虫侵染后，活性氧水平提高有利于增强砧木抗根结线虫的能力。这可能由于，活性氧参与植物与病原物的互作过程，如木质素、植保素合成以及过敏性坏死反应等[20]。

图9 黄瓜和砧木根系及叶片中过氧化物酶活性变化Fig.9 The changes of POD activity in roots and leaves of cucumber and rootstocks

3.2不同抗性砧木和黄瓜感染南方根结线虫后苯丙烷类代谢特征差异

苯丙烷代谢可生成酚类、木质素等多种次生代谢产物，这些次生代谢产物在植物抗病、抗逆反应中起重要作用[21]，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）是该代谢过程的关键酶。多酚氧化酶（PPO）是苯丙烷代谢过程的重要氧化酶，当植物细胞受损害时，能够催化液泡中释放的酚类物质转化为醌类物质，从而保护植株避免进一步受害[22]。病原菌侵染后，抗病品种产生的PAL和PPO活性远高于感病品种[23,24]。本研究结果表明，根结线虫侵染引起‘云南黑籽南瓜'、‘甜砧'和‘新泰密刺'黄瓜的根系及叶片中PAL和PPO活性显著升高，以‘云南黑籽南瓜'的活性最高，升幅最大。三个材料根系中PAL和PPO活性均在侵染初期表现强烈，随后逐渐减弱，这与郭衍银等[25]在生姜、徐小明等[26]在茄子上的研究结果相似。

总酚可保护植物免受微生物侵染，其产生速度和积累量可直接反应植物抗病性强弱[27]；木质素是细胞壁的重要组成成分，通常以增强寄主细胞的机械强度、限制营养物质向病原菌扩散等多种方式抵抗病原菌的侵染[28]。梁朋[29]发现，番茄接种南方根结线虫后，嫁接苗叶片中总酚和木质素含量显著高于自根苗。本试验中，根结线虫侵染引起三个材料根系及叶片中木质素和总酚含量显著增加，这是植株对线虫侵染所产生的积极响应，但不同材料间存在差异，低感砧木‘云南黑籽南瓜'的反应更敏感。

3.3不同抗性砧木和黄瓜感染南方根结线虫后病程蛋白活性差异

几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶是植物的重要病程相关蛋白。线虫卵壳和体壁的主要成分是几丁质，当植物被线虫侵染时，可诱导产生CHT[30]，而GLU具有协同CHT的效应[31]。徐小明等[18]、贾双双[19]研究表明，根结线虫侵染后，茄子、番茄砧木中CHT和GLU活性均升高，但抗病品种的增幅高于感病品种，表明两种酶的活性表达与南方根结线虫侵染密切相关，是抗线虫的机制之一。本试验中，接种南方根结线虫的三个材料体内CHT和GLU活性均显著升高，但以‘云南黑籽南瓜'活性最高、增幅最大，从而使之表现出更强的抗根结线虫能力。根结线虫侵染对过氧化物酶(POD)活性的影响，研究结果并不一致。Zacheo等[32]研究表明，番茄接种南方根结线虫后，抗性品种根系POD活性降低，而感病品种则升高。而叶德友等[33]研究表明，接种南方根结线虫的抗病与感病黄瓜POD活性均有升高，但抗病材料的增幅大于感病材料。由此看来，POD活性对根结线虫侵染的反应具有复杂性。本试验中，根结线虫侵染导致三个材料的根系与叶片POD活性均显著增高，其中低感砧木‘云南黑籽南瓜'增幅最大，活性最强，而黄瓜最弱，研究结果与叶德友等[33]一致。

综上所述，南方根结线虫侵染后，黄瓜和嫁接砧木均表现出相应的生理生化变化，低感砧木‘云南黑籽南瓜'在活性氧代谢、苯丙烷代谢和病程相关蛋白代谢方面强于高感砧木‘甜砧'和‘新泰密刺'黄瓜，具有较好的抗病能力。

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ThePhysiologicalandBiochemicalResponseofCucumber Rootstocks with Different Resistance against Meloidogyne incognita

WANG Yan-yan1,WEI Min1,2*,SHEN Qiong1,LI Yan1,2,SHI Qing-hua1,2
1.College of Horticultural Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Tai'an271018,China;
2.Scientific Observing and Experimental Station of Environment Controlled Agricultural Engineering in Huang-Huai-Hai Region,Ministry of Agriculture,P.R.China,Tai'an271018,China

Grafting is an effective way to enhance the resistance of cucumber to knot nematode.The study compared the physiological and biochemical metabolism among the seedlings of nematode low sensitive cucumber rootstock variety‘Figleaf gourd',highly sensitive‘Tianzhen'and cucumber‘Xintaimici'after artificial inoculated withMeloidogyne incognita.The results showed that after inoculated withMeloidogyne incognita,both roots and leaves of the three materials had higher reactive as the metabolism of active oxygen,phenylpropanoid metabolism and pathogenesis-related protein metabolism.The generation rate of reactive oxygen,the content of hydrogen peroxide,total phenolic,phenylalanine ammonia-lyase activity and other enzyme activities increased firstly and then decreased,but the content of lignin increased slowly,and the‘Figleaf gourd'had the highest content,activity and growth.

Cucumber;rootstock;Meloidogyne incognita;physiological and biochemical reaction

1000-2324(2014)04-0522-07

2012-10-12

2012-12-03

国家“十二五”科技支撑计划课题(2011BAD12B04);山东省科技攻关计划(2010GNC10939);山东省自然科学基金(ZR2010CM016)

王艳艳(1987-),女,硕士,研究方向:设施蔬菜与无土栽培.

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:minwei@sdau.edu.cn