三聚氰胺荧光猝灭法测定维生素K3

董存智，吴雯辉

（淮北师范大学 化学与材料科学学院，安徽 淮北 235000）

维生素K3（VK3）具有萘醌结构，其主要生理作用是促进血浆凝血因子的合成并参与人体的钙代谢，可用于治疗维生素K缺乏所引起的出血性疾病，属于促凝血药［1］.测定VK3的方法有光度法［2-3］、电化学法［4-5］、荧光法［6-7］、色谱法［8］等.由于VK3的不饱和酮结构共轭体系较小，不能产生荧光，因此，测定VK3的荧光光度法主要是基于将VK3还原成具有荧光的醌萘酚化合物，通过测定醌萘酚化合物的荧光强度，求得VK3的含量，还原程度有可能对测量准确度产生影响.三聚氰胺俗称蛋白精，是三嗪类含氮杂环化合物，其分子中含有共轭双键（π键）结构.在碱性介质中，当受到紫外光照射后，其环外氨基上的n电子激发转移到环上，由于n电子的电子云几乎与环上π轨道平行，共享了共轭π电子结构，扩大了其共轭双键体系，故可发出较强的荧光［9］.基于其与Ag（I）发生络合反应，生成不发荧光的络合物，已用于定影废液中Ag（I）的测定［10］.实验发现，在B-R缓冲溶液中，VK3与三聚氰胺作用，使三聚氰胺的荧光发生猝灭.由此，建立了荧光猝灭法测定VK3的新方法.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FP-6500荧光分光光度计（日本分光株式会社）.三聚氰胺溶液：2.0 g/L.VK3乙醇溶液：0.10 g/L（20%乙醇）.伯瑞坦-罗比森缓冲溶液（B-R）：pH 7.0.本实验用水均为超纯水，试剂均为分析纯.

1.2 测定方法

在2只10 mL比色管中分别加入2.0 g/L的三聚氰胺溶液2.0 mL；pH 7.0的B-R缓冲溶液0.5 mL；其中一支加入适量0.10 g/L VK3溶液或待测液，另一支为试剂空白；用水定容至10 mL；混匀后静置20 min.在λex/λem=256 nm/366 nm 处测量荧光强度，其中含VK3者的荧光强度为F，试剂空白的荧光强度为F0，计算ΔF=F0-F.

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

三聚氰胺荧光光谱如图1所示.由图1可知，在pH 7.0的B-R缓冲溶液中，当激发波长为256 nm时，三聚氰胺的发射峰位于366 nm处.三聚氰胺的荧光强度随着VK3浓度的增加而减弱，其减弱程度与VK3的浓度呈线性关系.实验选择的激发波长为256 nm，发射波长为366 nm.

图1 荧光光谱Fig 1 Fluorescence spectrum 1～3：Melamine +VK3 （0、4、8 mg/L）

图2 pH的影响Fig 2 Effect of pH

2.2 酸度的影响

按照实验方法，考察了Tris-HCl，硼酸-硼砂，B-R，巴比妥钠-HCl 等缓冲溶液的影响.试验结果表明，在B-R缓冲溶液中体系的荧光猝灭效果最好.改变B-R缓冲溶液的pH值，实验结果如图2所示，实验发现pH在4.1～11.5之间时体系的测量结果变化不明显，ΔF在7.0时有最大值.改变pH 7.0的B-R缓冲溶液用量，试验发现加入量为0.5 mL时体系的ΔF有最大值，因此，实验选择pH 7.0的B-R缓冲溶液的加入量为0.5 mL.

2.3 反应时间的影响

按实验方法，改变反应时间测量荧光强度与反应时间的关系，实验发现，反应20 min后体系的荧光强度趋于稳定，体系的ΔF值在20-150 min内保持稳定，因此，反应时间选择为20 min.

图3 反应时间的影响Fig 3 Effect of reacting time

图4 工作曲线Fig.4 Working curve

2.4 三聚氰胺用量的影响

按实验方法，改变2.0 g/L的三聚氰胺溶液的加入量，实验结果表明，随着三聚氰胺用量的增大，体系的ΔF值增加，但用量过大时，三聚氰胺本身发生自体淬灭作用，综合考虑灵敏度和线性范围，实验选择三聚氰胺溶液的加入量为2.0 mL.

2.5 干扰试验

在实验条件下，试验了不同物质对VK3测定的影响，当VK3浓度为6 mg/L，实验相对误差在±5%以内时，各种物质的允许共存倍数分别为：β-环糊精600倍；NH4+500倍；K+400倍；葡萄糖、Zn2+、SO42-、Mg2+、肝素钠、VC50倍；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、尿素30倍；甘氨酸 20倍；辅酶15倍.

2.6 工作曲线

按实验方法，改变VK3的加入量测量荧光强度.实验结果用最小二乘法进行拟合，得到回归方程为：

相关系数为0.998，方法的线性范围为0.10～10.00 mg/L，根据12次空白实验的3σ值求得方法的检出限为0.085 mg/L.

2.7 样品分析

取不同厂家生产的维生素K3粉（饲料添加剂）0.10 g（标示量为每克含有5%的VK3），于研钵中研细混匀后置于小烧杯中，加0.10 mol/L NaOH 数滴及少量水使之溶解，转移到100 mL容量瓶中，用水定容.实验时移取0.40 mL试液，按照实验方法对样品中VK3进行测定，并做加标回收试验，实验结果见表1.由实验结果求得所测的维生素K3粉中VK3的含量为5.04%-5.33%.

表1 样品分析结果（n=5）Tab.1 Analytical results of samples

2.8 猝灭机理与热力学参数

引起体系荧光猝灭的原因可能包括动态猝灭和静态猝灭两种.动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，其过程遵循Stern-Volmer方程［11］：

式（1）中F、F0分别为猝灭剂（即VK3）存在和猝灭剂不存在时的荧光强度，Ksv为动态猝灭常数，Kq为双分子猝灭过程速率常数，［Q］为猝灭剂浓度，τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命.而静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从而导致荧光强度降低的过程，此过程可用下式描述：

式（2）中，K是配合物的形成常数.

2.8.1 温度的影响

按实验方法，分别恒定温度为20 ℃、30 ℃、40 ℃，测定体系荧光强度随猝灭剂浓度的变化情况，以F0/F对［Q］作图（图5），求出20 ℃、30 ℃、40 ℃下的K值分别为 1.49×104L·mol-1、1.25×104L·mol-1、1.10×104L·mol-1.按照一般荧光分子τ0为10-8s 计算的Kq数值为1012L·mol-1·s-1，远大于扩散碰撞速率常数2.0×1010L·mol-1·s-1，且随着温度的升高K值降低.说明在实验条件下，VK3对三聚氰胺的猝灭属于静态猝灭，此时VK3与三聚氰胺之间可能形成不发荧光的基态配合物.

图5 Stern-Volmer 曲线Fig 5 Stern-Volmer curve

2.8.2 热力学参数

根据如下热力学公式：

由20 ℃、30 ℃的K值，计算热力学参数焓变ΔH、熵变ΔS和自由能变ΔG，结果列于表2.从表2可看出VK3与三聚氰胺结合过程的ΔH＜0，表明反应为放热反应，升高温度将不利于其向生成VK3-三聚氰胺配合物的方向进行，VK3与三聚氰胺的结合常数随温度升高而减小，配合物稳定性下降；反应的ΔG＜0，说明VK3与三聚氰胺结合过程是一个自发过程.

表2 VK3与三聚氰胺结合的热力学参数Tab.2 Thermodynamic parameters of melamine–VK3 binding procedure

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