Hsa-miR202通过下调IL-10的表达抑制肺癌A549细胞的增殖

范小斌 林秋雄 罗燕飞

·基础研究·

Hsa-miR202通过下调IL-10的表达抑制肺癌A549细胞的增殖

范小斌①林秋雄②罗燕飞①

目的：探讨Hsa-miR202（人微小非编码RNA-202）对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制。方法：将Hsa-miR-202序列与ppG/miR/eGFP/Blasitidin质粒定向连接，构建靶向Hsa-miR-202基因的真核表达载体pmiR-202，运用脂质体将pmiR-202转染至A549细胞，WST-8法检测细胞增殖率，RT-PCR检测IL-10、miR-202的相对表达水平，Western blot与ELISA检测IL-10蛋白的表达水平，构建荧光素酶报告基因载体验证miR-202与IL-10的相互结合作用。结果：经DNA测序证实与设计完全一致，测序结果显示成功构建了miR-202的真核表达载体（pmiR-202），pmiR-202对A549细胞的增殖抑制率（24、48、72 h）分别为12%、38%、52%，并具有时间效应关系，较空白对照组及阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；RT-PCR结果显示，转染pmiR-202后，miR-202的表达水平增加；过表达miR-202能下调IL-10基因及蛋白的相对表达水平，其相对水平分别为25%、0.75，IL-10活性的相对表达量为3.26±0.43 pg/mL，较空白对照组及阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）：荧光素酶活性结果显示，克隆IL-10-3'UTR的质粒与miR-202 mimics共转染293T细胞，引起荧光素活性的减低。结论：pmiR-202有效抑制A549细胞的增殖，并具有时间-效应关系，其机制可能是miR-202通过靶向结合IL-10的3'UTR从而下调其在A549细胞的表达有关。

Hsa-miR202 IL-10 肺癌 A549细胞 增殖

MicroRNA miRNA是一类长21～25个核苷酸的小分子非编码RNA，通过与特定mRNA 3'UTR结合抑制蛋白质表达参与生物的发育代谢及肿瘤的发生、发展等生命现象［1］。miRNA在正常肺组织和肺癌组织、小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）、肺癌和其他实体肿瘤甚至于其他疾病中的表达模式不同。这种不同不但存在于实体肿瘤中，同时也存在于患者的血浆和血清中［2］。miR-202在肺癌细胞呈低表达，具有抑癌的作用［3］，因此运用过表达技术，探讨miR-202对肺癌的生物作用，对指导临床上肺癌的靶向基因治疗具有潜在的意义。

白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是一种具有多向性生物活性的强免疫抑制因子，能通过自分泌或旁分泌的方式促进肿瘤生长，并能抑制细胞程序性死亡，调节宿主微环境，影响肿瘤的转移［4-5］。IL-10是肺癌细胞的自分泌因子，在肿瘤微环境中产生并释放至外周血中，具有诊断标志物的应用前景［6-7］。运用生物学软件（TargetScan 6.2）预测到MiR-202的靶基因IL-10，生物学信息提示两者之间存在可能相互调控关系，本研究旨在运用构建miR-202真核表达载体质粒，观察其对肺癌A549细胞增殖作用及分子机制，为进一步揭示肺癌的发病机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM/F12培养基、Opti-MEM培养基（美国Gibco公司）；脂质体LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；真核表达载体质粒ppG/miR/eGFP/Blasitidin（上海吉玛公司）；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶（日本TaKaRa公司）；琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒、质粒小量提取试剂盒（美国Omega公司）；CCK-8（Cell Count Kit-8）试剂（日本同仁化学研究所）；SYBR green试剂盒、逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；HEK293T、A549细胞株由暨南大学医学院生化教研室惠赠；多克隆IL-10抗体、单克隆抗体GAPDH（武汉博士德生物工程有限公司）；ECL试剂盒（碧云天生物技术研究所）Hsa-miR-202（5'-AGAG GUAUAGGGCAUGGGAA3'，MIMAT0002811）miRNA抑制剂（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/get_seq.pl？acc=MI zMAT0002811）；阴性对照序列与阴性对照抑制剂购自上海锐博公司。

1.2 方法

1.2.1 Hsa-miR-202真核表达载体的构建 Hsa-mi R-202表达载体模板中的loop结构选用了TTGGCCACTG ACT以避免形成终止信号，microRNA表达载体正义链模板的5'端添加了TGCT；反义链模板的5'端添加了GTCC。Hsa-miR-202（5'-AGAGGUAUAGGGCAUGGG AA-3'，MIMAT0002811），质粒构建与制备参照文献［6］，质粒的鉴定测序送上海吉玛公司完成。

1.2.2 细胞培养和转染 A549细胞用含10%小牛血清的DMEM/F12培养基在37℃、5%CO2培养箱在培养，每3 d传代1次。取对数生长期的A549细胞，严格按LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书操作进行。实验分为3组：空白对照组（不加转染试剂），pmiR-202组（含有ppG/miR-202/eGFP/Blasitidin质粒、LipofectamineTM2000），阴性对照组（negative group NC，含 LipofectamineTM2000、质粒 ppG/miR/ eGFP/Blasitidin）。

1.2.3 WST-8法检测细胞增殖抑制率 将1.0×105个/mL A549细胞接种于96孔细胞培养板，使pmiR-202终浓度分别为1.6 μg/mL，每组设5个复孔，非特异性对照组终浓度为1.6 μg/mL。置37℃、5% CO2培养24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育1 h，酶标仪检测吸光度（A450/655 nm）值并计算各组增殖抑制率。公式：增殖抑制率（%）=（1-ApmiR-202组/A空白对照组）×100%。

1.2.4 构建荧光素酶报告基因载体 运用生物学信息软件预测miR-202靶基因为IL-10（http：//www.targetscan. org/cgi-bin/targetscan/vert_61/targetscan.cgi?species=Hu man&gid=&miR_c=miR-202-3p&miR_sc=&mir_nc=&mi rg=&sortType=&allTxs=&incl_nc=100）。提取A549细胞基因组DNA作为PCR扩增模板，调取IL-10全长的3'UTR序列，扩展引物分别添加XhoI和NotI酶切位点，XhoI和NotI双酶切PCR扩增产物，随后将扩增片段连接至psiCHECK-2载体上。连接产物转化感受态DH5a大肠杆菌，酶切鉴定正确的阳性克隆送测序。将构建好psiCHECK-2-IL-10-3'UTR与psiCHECK-2-IL-10-3'U TR-mut质粒按照以下分组进行转染：1）contrtol；2）miR-202 mimics（50 nmol/L）；3）negative control or NC group，50 nmol/L；4）NI group，100 nmol/L，miRNA inhibitor；5）NCI group，50 nmol/L，a negative control for N）。RNA-Lipofectamine 2000复合物的配制严格按LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书操作进行共转染HEK293T，最后双荧光检测。

1.2.5 RT-PCR检测IL-10的表达水平 细胞分组同1.4，用Trizol法提取RNA，Premir-202转染A549细胞，于转染后的48 h分别于荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达；进而采取TRizol试剂提取RNA。采用M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA。作为PCR反应的模版。miR-202 RT：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGTTCCCAT-3'）；miR-202F：5'-ACACTC CAGCTGGGAGAGGTATAGGGCATGG-3'；miR-202R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'）；扩增片段大小72 bp。GAPDH-F：5'GGATTTGGTCGTATTGGG-3'；GAPD H-R：5'GGAAGATGGTGATGGGATT-3'；U6-F：5'-CT CGCTTCGGCAGCACA-3'；U6-R：5'-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'；扩增片段大小94 bp。采用SYBRgreen掺入法进行荧光定量PCR反应，95℃5 min预变性，95℃15 s，60℃15 s，72℃32 s，共40个循环，所有的样本检测均包含一个不加模板的阴性对照，以排除假阳性的结果。计算运用2-△△Ct值来比较对照组和实验组的目的基因mRNA相对表达量的差异。

1.2.6 Western blot检测细胞IL-10的相对表达水平细胞分组同转染同本文1.2.5，培养48 h，消化收集各组细胞。按细胞裂解液（RIPA）说明书提取细胞蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据定量结果对各蛋白质样本进行校正。加入样品溶解液和样品，置沸水中煮5 min。不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶），电压80 V，进入分离胶后改为120 V，40 min。将凝胶上的蛋白条带转至硝酸纤维膜（NC）上，半干式转膜15V，18 min；TBST洗膜5 min，5%牛血清白蛋白封闭缓冲液室温封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。4℃过夜孵育一抗。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入电化学（electrochemiluminescence，ECL）试剂，显影。BI-2000型图像分析软件分析IL-10和GAPDH的积分光密度，以GAPDH作为内参。

1.2.7 ELISA检测IL-10蛋白的表达水平 将本文1.2.6中提取的蛋白50 μL加入到抗体包被板条的相应孔中，37℃孵箱孵育90 min。洗板4次；加入生物素化抗体工作液，37℃孵箱孵育60 min。洗板4次，加入酶结合物工作液。37℃孵箱孵育30 min。洗板4次；加入显色剂，避光37℃孵箱孵育10～15 min；加入终止液，混匀后即刻测量OD450值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，用完全随机设计的单因素方差分析（one-way ANOVA）分析组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒的测序鉴定结果

重组质粒pmiR-202的测序结果与设计的引物序列完全相符，所含目的基因序列准确无误，表明成功构建了重组真核表达载体（图1）。

2.2 pmiR-202对A549细胞增殖的影响

采用1.6 μg/mL pmiR-202转染至A549细胞作用24 h、48 h、72 h后，增殖抑制率分别为12%、38%、52%，具有时间效应关系，较空白对照组及阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明过表达miR-202后，能有效抑制A549细胞的增殖（图2）。

图1 重组质粒测序图Figure 1 Diagrams of recombinant plasmid sequence

图2 pmiR-202对A549细胞增殖抑制的影响Figure 2 Effects of pmiR-202 on proliferation inhibition of A549 cells

2.3 miR-202与IL-10 3'UTR相互结合作用

运用miRNA靶基因预测软件TargetScan（human 6.2版本）预测到miR-202 3'UTR序列139 bp和146 bp处有miR-202结合位点。将IL-10 3'UTR全长序列（1 033 bp）克隆到pisCHI-2载体上luciferase基因的下游，构建psiCHECK-2-IL-10N-3'UTR载体，同miR-202 mimics共转染细胞。进一步分别检测突变结合位点1（505 bp）、结合位点2（869 bp）和同时突变两个结合位点（505、869 bp）确证 miR-202与IL-103'UTR的直接结合作用。共转染miR-202 mimics和psiCHECK-2-IL-10-3'UTR可以显著减少luciferase的活性（P＜0.05），而突变结合位点1、2或同时突变两个结合位点，lusiferase的活性几乎不受影响，证明miR-202通过直接结合到IL-10 3'UTR上而发挥调控作用（图3）。

图3 荧光素酶活性的比较Figure 3 Comparison of luciferase activity

2.4 pmiR-202对miR-202、IL-10相对表达水平的影响

运用1.6 μg/mL的pmiR-202转染至A549细胞作用48 h后，RT-PCR分别检测miR-202、IL-10相对表达水平，过表达miR-202后，A549细胞内miR-202表达水平明显增加，其相对表达水平为145%，较空白对照组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明构建的pmiR-202质粒有效，实现了miR-202在A549细胞内的过表达。过表达miR-202后，在A549细胞内IL-10相对表达水平显著下调，其相对表达水平为35%，较空白对照组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），结果说明miR-202通过直接结合到IL-10-3'UTR下调靶基因IL-10的表达水平（图4）。

图4 pmiR-202对miR-202、IL-10相对表达水平的影响Figure 4 Effects of pmiR-202 on the relative expression levels of miR-202 and IL-10

2.5 pmiR-202对IL-10蛋白相对表达水平的影响

用1.6 μg/mL的pmiR-202转染至A549细胞作用48 h后，运用Western blot检测IL-10蛋白的相对表达水平。过表达miR-202后，在A549细胞内IL-10蛋白相对表达水平显著降低，其相对表达水平为0.75，较空白对照组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。运用ELASA方法检测IL-10的相对活性，pmiR-202组IL-10的相对表达量为3.26±0.43 pg/mL，明显低于空白对照组（18.79±0.36 pg/mL）与阴性对照组（17.2±1.2 pg/mL）。结果说明miR-202通过直接结合到IL-10-3'UTR下调靶基因IL-10的蛋白表达水平。

图5 pmiR-202对IL-10蛋白相对表达水平的影响Figure 5 Effects of pmiR-202 on the relative protein expression levels of IL-10

3 讨论

早发现、早诊断仍是肺癌治疗的关键［8-9］。miRNA的表达具有时空特异性，在不同组织不同发育阶段中miRNA的水平有显著性差异。这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性，miRNA的表达谱不仅指miRNA的种类，也指各种miRNA的丰度，直接反映了细胞组织的分化发育状态。miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式，这为肿瘤的基因诊断提供了一种新方法［10］。

研究表明Hsa-miR-202在肿瘤的形成中具有促癌与抑癌的作用。石棉作业的肺癌患者的肺癌组织miR-202呈低表达，可能抑制肺癌的发生与发展［11］。Yu等［12］利用RT-PCR分析112例非小细胞肺癌患者组织miR-202/let-7、miR-137miR-182和miR-372的表达情况，发现可以利用这些microRNA的综合表达情况来对患者进行诊断。因此，本研究选取在肺癌中具有抑癌作用的Hsa-miR-202，构建其真核表达载体质粒，运用质脂体2000转染至A549细胞，实现其在细胞中的稳定表达，充分发挥其抑癌作用。DNA测序证实与设计完全一致，测序结果显示成功构建了miR-202的真核表达载体（pmiR-202），pmiR-202对A549细胞的增殖抑制率（24、48、72 h）分别为12%、38%、52%，具有时间效应关系。

支气管肺癌的组织匀浆中IL-10水平升高，免疫组化证实IL-10源于肿瘤细胞。肺癌患者的TNM分期越晚，CD4+CD25+T和IL-10的表达水平越高［13］。CD4+CD25+T和IL-10水平随着肿瘤浸润转移程度的增加而升高，从而进一步改变宿主对肿瘤细胞的反应，使肿瘤细胞逃避机体的免疫杀伤［4，7］。本研究而转染pmiR-202后，能下调IL-10的相对表达水平空白对照组miR-202呈高达，研究结果证实了以上报道。miR-202调控NMYC的表达，并且能够抑制高扩增NYMC神经母细胞瘤的增殖［14-15］。为了进一步探讨miR-202与IL-10相互调控关系，运用生物学信息软件（Target Scan 6.2）预测到MiR-202的靶基因为IL-10，将克隆IL-10-3'UTR的质粒与miR-202 mimics共转染293T细胞，引起荧光素活性的减低。结果表明miR-202与IL-10存在相互调控关系。同时，miR-202通过直接结合到IL-10-3'UTR下调靶基因IL-10基因与蛋白的表达水平。

综上所述，pmiR-202有效抑制A549细胞的增殖，并具有时间-效应关系，其机制可能是miR-202通过靶向结合IL-10的3'UTR，从而下调其在A549细胞的表达。但是本研究仅运用了一株细胞株作为研究对象，存在一定的缺陷，今后将研究miR-202用动物实体瘤的生物学作用，为更深层次揭示miR-202在肺癌的调控机制奠定基础。

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（2014-05-05收稿）

（2014-10-20修回）

（本文编辑：杨红欣）

范小斌 专业方向为肿瘤临床检验。

E-mail：fanxiaobinvip@163.com

Hsa-mir-202 inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells by reducing expression of IL-10

Xiaobin FAN1,Qiuxiong LIN2,Yanfei LOU1

1Department of Clinical Laboratory,2Medical Research Centre,Guangdong Provincial Academy of Medical Science and the People's Hospital of Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

Objective:To study the effects of the overexpression of hsa-miR-202 on the proliferation and molecular mechanism of lung cancer A549 cells.Methods:A sequence of hsa-miR-202 with ppG/miR/eGFP/Blasitidin pasmid was directionally connected and a eukaryotic expression vector pmiR-202 of the target hsa-miR-202 gene was constructed.pmiR-202 was transtected to A549 cell with Lipofectamine 2000.The WST assay was used to detect the cell proliferation rate,and RT-PCR was used to detect the relative gene expression levels.Western blot analysis was used to detect the IL-10 protein expression levels.The interaction between miR-202 and IL-10 was examined using a luciferase reporter assay.Results:The design from the DNA sequencing results shows that a eukaryotic expression vector of miR-202 was successfully constructed.The proliferation inhibition rates of A549 cells by Pmir-202 were 12%, 38%,and 52%.The differences in the treatment group compared with the blank control and negative control groups were statistically significant.The RT-PCR results showed that the relative expression levels of miR-202 increased after transfection with pmiR-202.Overexpression of miR-202 can downregulate the relative gene and protein expression levels of IL-10,and the relative levels were 25%and 0.75,respectively.Compared with the blank control and the negative control groups,the difference was statistically significant(P＜0.05).The fluorescent activity was reduced when transfection was performed with miR-202 mimics,and IL-10-3'UTR plasmid was cloned.Conclusion:pmiR-202 effectively inhibited the proliferation of A549 cells and exhibited a time-effect relationship with miR-202 by targeted combination with IL-10 3'UTR to downregulate IL-10 expression inA549 cells.

hsa-mir-202,IL-10,lung cancer,A549 cells,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.20140643