盐酸吡咯列酮对动脉粥样硬化兔主动脉脂联素表达的影响

潘军强，姚晓伟，周 鑫，韩稳琦，李国良，孙超峰

(1. 西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科，陕西西安 710061；2. 陕西省人民医院心脏内二科，陕西西安 710068)

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)相关疾病是目前人群死亡的首位原因，在我国发病率、致残率和死亡率呈逐年上升趋势。目前，公认为AS是一种大、中型动脉血管的慢性非特异性炎症病变[1]。脂联素(adiponectin, APN)是脂肪组织所表达和分泌的一个与胰岛素抵抗关系最紧密的特异性细胞因子[2]，可通过抑制单核巨噬细胞中清道夫受体-1的表达而抑制脂质的聚集，使巨噬细胞对脂质吞噬减少，不向泡沫细胞转化[3]，从而延缓动脉粥样硬化的发生、发展[4]。吡格列酮属于噻唑烷二酮类药物，是近年来备受推崇的一类治疗糖尿病的新药，相关研究表明其可通过激动过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)上调APN的表达，抑制许多炎症因子的转录，表现出抗AS作用[5-8]。本研究以AS易感动物，遗传性高脂血症(watanabe heritable hyperlipidemic, WHHL)兔为研究对象，给予高胆固醇饮食同时建立动脉粥样硬化模型后观察新型噻唑烷二酮类药物盐酸吡格列酮对兔动脉粥样硬化斑块内ANP表达的影响，探讨噻唑烷二酮类药物抗动脉粥样硬化的作用机制，为此类药物用于人类动脉粥样硬化的预防和治疗提供研究基础。

1材料与方法

1.1实验动物及药品本组选择新西兰兔36只，雄性，1月龄，体质量1.3～1.6 kg，购自西安交通大学医学院实验动物中心。实验室适应性喂养普通饲料1周后，称重，随机分为3组：正常对照组12只，饲喂正常饲料120 g/d；高胆固醇饮食组12只，饲喂高胆固醇饲料120 g/d；高胆固醇饮食加吡咯列酮组12只，高胆固醇饲料120 g/d+吡格列酮8 mg/(kg·d)灌胃，喂养8周后处死每组动物。高胆固醇饲料按照西方饮食饲料配方：胆固醇2%，蛋黄粉5%，猪油8%，基础饲料85%。盐酸吡格列酮片(瑞彤)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H20040631，15 mg/片。生产批号：08042151。

1.2试剂及仪器脂联素抗体(anti-adiponectin)，产品规格：浓缩液(1 mg/mL) 亲和纯化抗体，产品编号：bs-0471R，北京博奥森生物技术有限公司。抗体稀释液，北京中杉金桥生物技术有限公司。PV-6000通用型二步法免疫酶标组织化学染色检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。0.01 mol/L PBS缓冲液，北京中杉金桥生物技术有限公司。0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，北京中杉金桥生物技术有限公司。光学显微镜(BX-51型)Olympus，Japan。病理图文分析系统PIPS2000，重庆天海医疗设备有限公司。

1.3标本取材及留取以上各组实验动物分别在预定实验终点给予耳缘静脉注射30 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg全身麻醉后左心室取血5 mL并注入空气20 mL空气栓塞处死动物。血液注入不含抗凝剂普通试管，静置后离心分离血清。立即开胸并剪开右心房，自左心室灌注福尔马林固定主动脉；分离主动脉，取出从近主动脉弓部到髂动脉分叉处全部主动脉，清除血管外组织，生理盐水冲洗，置于中性甲醛缓冲液中固定。

1.4Masson染色后的镜下观察通过Masson染色观察动脉硬化分级：0级：正常血管；1级：少于50%的外膜受累，内膜增生占管腔不超过20%；2级：50%～100%的外膜受累轻度纤维化，内膜增生不超过管腔的20%；3级：100%外膜受累，中度纤维化。内膜增生占管腔的20%～50%；4级：100%外膜受累，重度纤维化，内膜增生达管腔的50%～80%；5级：全部管腔闭锁。

1.5免疫组化特异性染色后的镜下观察免疫组织化学染色法观察主动脉血管内皮脂联素表达水平。结果判定：血管壁脂联素蛋白的表达阳性结果为血管壁染成棕黄色，显微镜显影系统采集图像，选择血管壁随机取3个视野(×400)，计算机自动测量并计算阳性信号积分吸光度(A)值。

2结果

2.13组AS斑块面积的变化高胆固醇饮食加吡咯列酮组、高胆固醇饮食组AS斑块面积与动脉内膜面积比值均高于正常对照组，差异有统计学意义[(48.35±4.33)%vs. (0.00±0.00)%，(58.11±8.34)%vs. (0.00±0.00)%；P<0.01]；高胆固醇饮食加吡咯列酮组AS斑块面积与动脉内膜面积比值低于高胆固醇饮食组，差异有统计学意义[(48.35±4.33)%vs. (58.11±8.34)%；P<0.05]。

2.23组内膜厚度、内膜/中膜厚度比的比较高胆固醇饮食加吡咯列酮组与高胆固醇饮食组内膜厚度、内膜/中膜厚度比均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；高胆固醇饮食加吡咯列酮组内膜厚度、内膜/中膜厚度比低于高胆固醇饮食组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 3组内膜厚度、内膜/中膜厚度比的比较

与正常对照组比较，*P<0.05；与高脂饮食组比较，#P<0.05。

2.33组动脉壁及AS斑块Masson染色的结果正常对照组动物主动脉硬化为0级，高胆固醇饮食组动物主动脉硬化4级以上，高胆固醇饮食加吡咯列酮组主动脉硬化3～4级(图1)。

2.43组脂联素特异性免疫组织化学染色表达阳性面积比的比较高胆固醇饮食加吡咯列酮组、高胆固醇饮食组血管壁脂联素蛋白表达A值均低于正常对照组，差异有显著性(0.356±0.045vs. 0.543±0.073，0.278±0.083vs. 0.543±0.073；P<0.05)；高胆固醇饮食加吡咯列酮组血管壁脂联素蛋白表达A值高于高胆固醇饮食组，差异有显著性(0.356±0.045vs. 0.278±0.083；P<0.05，图2)。

图1 动脉壁及AS斑块的组织、病理学改变

图2 动脉壁及AS斑块脂联素蛋白的表达

3讨论

APN是由脂肪细胞分泌的一种具有抗动脉粥样硬化、调节胰岛素抵抗及对血管内皮细胞进行保护作用的特异性蛋白质[9]。最近研究发现：APN可使内皮细胞减少对白介素-8和组织因子等炎症因子的表达[10]，降低内皮细胞和白细胞相互作用[11-12]，抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化，减少对氧化的低密度脂蛋白摄取，降低泡沫细胞内脂质堆积[13]，从而保护血管结构，抑制AS的发生、发展。以上研究清楚地描述了脂联素延缓动脉粥样硬化的发生、发展的机制并阐明脂联素与AS密切相关。

PPAR-γ是由配体激活的核受体家族成员，通过与其配体结合来调节多种靶基因的转录水平。PPAR-γ的配体分为天然配体和合成配体，后者主要是噻唑烷二酮类药物。目前，临床上常用的是吡格列酮和罗格列酮两种胰岛素增敏剂。大量的实验表明，PPAR-γ及其配体在巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞中均有表达，具有直接的血管效应，激活后可直接在血管壁水平发挥延缓AS发生、发展的作用。此外，PPAR-γ在调节脂联素合成上起重要作用，应用噻唑烷二酮后脂联素基因启动子的活性明显增强。

吡格列酮是人工合成的特异性PPAR-γ激动剂，也是临床上用于治疗2型糖尿病的口服降糖药。近年来的研究表明在用吡格列酮治疗2型糖尿病、胰岛素抵抗患者后，血脂联素也明显升高[14]。本实验结果显示：正常新西兰兔进食高胆固醇饲料后，主动脉血管壁脂联素蛋白表达明显降低，高胆固醇饮食加吡咯列酮组主动脉血管壁脂联素蛋白表达高于高胆固醇饮食组低于正常对照组。即预防性服用吡格列酮可在一定程度上使主动脉血管壁脂联素蛋白表达阳性面积水平上调。这与目前的相关报道一致，随着对AS发病机制分子水平研究的不断深入，有关吡格列酮对APN的影响及在抗AS中的作用将成为新的研究热点。

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