胃癌患者循环肿瘤细胞的检测及临床意义*

李 熳 张志广 刘 霞 罗 丹

胃癌患者循环肿瘤细胞的检测及临床意义*

李 熳 张志广 刘 霞 罗 丹

目的：探讨胃癌患者外周血中循环肿瘤细胞的临床意义。方法：采集45例胃癌患者的外周血，应用密度梯度离心法和免疫荧光法检测外周血中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs），并比较其临床病理意义。结果：应用密度梯度离心法和免疫荧光法检测胃癌患者外周血中的CK19阳性肿瘤细胞即为CTCs。45例胃癌患者中27例为CTCs阳性，CTCs阳性与淋巴结转移（P=0.007）、远处转移（P=0.035）和复发密切相关（P=0.035），而与性别、年龄、肿瘤部位和TNM分期、肿瘤分化程度无关（P＞0.05）。结论：CTCs与胃癌的不良预后相关。

胃癌 循环肿瘤细胞 CK19 复发 密度梯度离心法

目前胃癌仍是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，其死因主要是肿瘤的早期转移和复发。Ashworth早在1896年就发现肿瘤患者血液中存在循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）。这些细胞潜伏于外周血、骨髓、淋巴结中，在适合的条件下浸润增殖，引起肿瘤的复发与转移。许多患者手术中并未发现淋巴结及远处转移，但不久后仍会出现肿瘤的复发，这可能与单独用影像技术不能够检测到微小残余癌细胞有关。

近年来随着生物实验技术的进步，检测肿瘤患者外周血中的CTCs已经成为可能［1］。对胃癌患者进行CTCs检测，可对于预测其复发转移有较大的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 收集天津医科大学第二医院消化内科2010年3月至2012年12月的胃癌患者45例，其中男性27例、女性18例，年龄40～80（64.38±9.05）岁。随访时间截止于2013年12月，术后复发时间为1～45个月，平均复发时间为（15.42±8.28）个月。选择同期在天津医科大学第二医院就诊的20例健康志愿者作为对照组，其中男性12例、女性8例，年龄22～67岁，平均年龄54岁。患者在性别构成和年龄具有均衡性。

1.1.2 主要试剂 人淋巴细胞分离液购于天津市川页生化制品有限公司；兔抗人CK19多克隆抗体购于武汉博士德公司；鼠抗人CD45单克隆抗体购于美国Santa公司；FITC标记山羊抗兔IgG抗体购于北京中杉金桥公司；TRITC标记羊抗鼠IgG抗体购于北京中杉金桥公司；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）购自美国Sigma公司。低分化胃腺癌细胞株BGC823由天津医科大学肿瘤医院研究所惠赠。

1.2 循环肿瘤细胞检测方法

1.2.1 标本采集 严格消毒后，应用真空采血针取肘正中静脉血10 mL，弃去穿刺后的前2 mL，以避免穿刺过程中皮肤上皮细胞的污染。所有血样加入肝素抗凝混匀，4℃存放，于采集后6 h内富集CTCs。

1.2.2 密度梯度离心法富集 将收集的外周血转移至50 mL离心管中，加入等量PBS液稀释。将上述稀释后血液缓慢贴壁加于等比例的人淋巴细胞分离液面上，在室温下置于水平离心机中，以2 000 r/min离心（离心半径16 cm）20 min。以毛细滴管收集第二层环状乳白色单个核细胞层于15 mL离心管中，加入10 mL PBS液洗涤2次，以1 800 r/min离心10 min，后冻存备用。

1.2.3 免疫荧光法染色 将富集所得单个核细胞悬液均匀涂于消毒的载玻片上，室温下静置30 min后用4%多聚甲醛固定抗原10 min，PBS清洗5 min×3次，-80℃保存备用。将载玻片从-80℃冰箱中取出至室温，PBS液浸泡10 min，0.5%Tritonx-100/PBS室温通透细胞膜30 min，PBS液洗涤细胞涂片5 min×3次。正常山羊血清封闭液覆盖标本表面，37℃孵育1 h，PBS清洗5 min×3次，滴加一抗CK19（1：100）、CD45（1：100）各200 μL覆盖标本表面，4℃孵育过夜；37℃复温1 h，FITC标记的二抗（1：100）和TRITC标记的二抗（1：100）各200 μL覆盖标本表面，避光37℃孵育1 h，在细胞区加入7 μL DAPI进行细胞核染色。封片剂Vector Shield封片，荧光显微镜下观察、计数。免疫荧光显微镜下观察、照相。以对数生长的胃癌细胞株为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。整个过程注意避光操作。

1.2.4 典型CTCs判定标准 1）细胞体积：大于周围白细胞体积；2）细胞核特征：DAPI染色明亮、核较大或小，但一定为较确定的核，核浆比例较大，核分裂增多及病理性核分裂，多核巨细胞；3）标记物免疫荧光染色情况：胞浆抗CK19（+）、CD45（-），显示为明确的细胞形态、具有清楚的细胞边界；4）细胞核（蓝色）与相应细胞浆抗原（绿色）染色部位基本重合（图1）。

目前国际尚无标准化的CTCs判定标准，经过鉴定符合上述标准的细胞，可以认为是上皮细胞组织来源的肿瘤细胞，即CTCs［2］。本实验中将CK19（+）、细胞数＞1个视为CTCs阳性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CTCs检测结果

对照组外周血中未检出循环肿瘤细胞，胃癌组患者外周血中60%（27/45）检出循环肿瘤细胞，两组阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 CTCs与胃癌临床病理特征的关系

CTCs阳性与胃癌组的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、TNM分期均无关（P＞0.05）；而与胃癌的淋巴结转移、远处转移和复发密切相关，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）

图1 CTCs的免疫荧光染色Figure 1 Immunofluorescence staining of circulating tumor cells(CTCs)

表1 胃癌患者不同临床病理特征与CTCs阳性率的相关性Table 1 Correlation between clinicopathological features and positive rates of CTCs in patients with gastric cancer

表1 胃癌患者不同临床病理特征与CTCs阳性率的相关性（续表1）Table 1 Correlation between clinicopathological features and positive rates of CTCs in patients with gastric cancer

3 讨论

循环肿瘤细胞（CTCs）是指由实体瘤原发病灶中脱离出来进入外周循环系统或淋巴系统，再通过外周循环，种植到血液、骨髓、淋巴结的肿瘤细胞［3-4］。虽然其在血液中极其微量，但可能是导致肿瘤转移复发的元凶。目前在转移性乳腺癌患者中应用CTCs监测能够预测患者预后，并且与组织学检测相比，具有近似无创、便于动态监测、敏感性更高等优势，有望成为一种用于转移性乳腺癌患者评价疗效和预测预后的具有“实时肿瘤活检（real-time tumor biopsy）”意义的新手段［5-7］。

随着敏感分子技术的发展，使得分离、计数外周血CTCs成为可能［8-9］。较多的CTCs分离、检测技术方法，现各有利弊。富集方法通常是基于CTCs的物理性质（如密度和大小）或免疫磁性，包括密度梯度离心法、过滤法、免疫磁性分选法。鉴定方法包括免疫学技术、RT-PCR技术、酶联免疫斑点（ELISPOT）技术和CTCs芯片技术［10］。密度梯度离心法具有操作性强、经济实用、细胞回收率高等优点，是目前常用的CTCs富集分离方法。免疫荧光法是最常用的CTCs检测方法之一，结合细胞形态学分析，可排除非特异染色细胞的干扰，检测的特异性进一步增强。据报道，CK19已成为上皮细胞及上皮来源肿瘤细胞较为敏感的标志物［11］，本实验中以CK19作为CTCs鉴定的标志物。CD45是正常白细胞特有的表面抗原，在富集过程中，有少量白细胞未能全部去除，在观察中必须排除白细胞对CTCs鉴定结果的干扰。故本实验将CK19阳性/CD45阴性的肿瘤细胞认定为循环肿瘤细胞。

近期研究表明CTCs与肿瘤的转移和预后密切相关［12-14］。本实验中观察了45例胃癌患者，其中CTCs阳性率为60%，与以往的文献报道一致。本研究发现CTCs阳性与胃癌患者的性别、年龄（≥60岁组和＜60岁组）、肿瘤部位（近端组和远端组）、分化程度（低分化组和中高分化组）和TNM分期无关，而在淋巴结转移组中CTCs阳性率（79.17%）较无转移组（38.10%）明显增高，在远处转移组中CTCs阳性率（78.95%）较无转移组（46.15%）亦明显增高，差异均有统计学意义。上述数据表明，胃癌中检测到CTCs可能是预测转移的指标之一。值得注意的是，胃癌的TNM分期是预测预后的独立危险因素之一，随着TNM分期的进展，患者易出现淋巴结转移和远处转移。但在本研究实验组中，TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期）中的CTCs阳性率（45%）并未比TNM（Ⅰ～Ⅱ期）的阳性率（72%）高，这可能与CTCs形成机制有关，并且发生转移是涉及多因素多环节的，并不是只与CTCs的形成有关，且本实验组病例数较少，不足以形成定论，今后还需进一步扩充病例来进行相关验证。本研究对45例胃癌患者进行随访，复发时间为1～45个月，复发组的CTCs阳性率（78.95%）较无复发组（46.15%）明显增高，这个结果说明CTCs的检出与胃癌预后密切相关。

胃癌患者死亡的最主要原因为远处转移病灶的发生，而CTCs的产生是远处转移发生的必要前提。因此，临床监测CTCs阳性表达对于早期预测转移及预后评价具有重要意义。在本课题的前期研究中［15］，通过小鼠体内实验发现缺氧可以诱发CTCs的形成，CTCs阳性的胃癌患者，其肿瘤组织是否高表达HIF-1a将是今后研究的目标。

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（2014-08-17收稿）

（2014-10-15修回）

（本文编辑：贾树明）

李熳 专业方向为胃癌肿瘤干细胞与循环肿瘤细胞及血管生成拟态的关系研究。

E-mail：13512003455@163.com

·读者·作者·编者·

“2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与临床化疗学术会议”第一轮会议通知

为促进我国抗肿瘤药物研究和应用的交流，增进对国际相关领域最新研究进展和动态的了解，由中国工程院医药卫生学部和中国抗癌协会抗癌药物专业委员会、中国药理学会肿瘤药理专业委员会联合主办，中国医科大学承办的“2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与临床化疗学术会议”将于2015年4月下旬在辽宁沈阳召开。

本次会议特邀国内外专家就近年来肿瘤药理及临床化疗的新进展、新动向作大会专题学术报告。会议将设分会场，由肿瘤药理研究及临床化疗界同仁作论文交流。欢迎全国抗肿瘤药物研究和应用相关领域的专家、学者、临床医师、研究研发人员以及研究生报名参加。（会议通知具体内容可于本刊网站进行浏览http://www.cjco. cn/CN/news/news605.shtml）

Detection and clinical significance of circulating tumor cells in patients with gastric cancer

Man LI,Zhiguang ZHANG,Xia LIU,Dan LUO
Department of Digestive System Diseases,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China
This work was supported by grants from The Scientific Funds of Tianjin Medical University(No.2008ky28)and the Development Funds of Scientific Projects for Colleges and Universities in Tianjin(No.20110130)

Objective:To detect circulating tumor cells(CTCs)in patients with gastric cancer and evaluate the relationship among CTCs,clinico-pathological characteristics,and prognosis of gastric cancer.Methods:Peripheral blood samples(10 mL in EDTA)were obtained from 45 patients with gastric cancer.CTCs were detected using density-gradient centrifugation and immunofluorescence staining.The clinical significance of the two methods were also compared and investigated.Results:CTC-positive case was defined by the presence of at least one CK19(+)-CTC per 10 mL of the sample.CTCs were found in 27 of the 45 patients with gastric cancer.The presence of CTCs was significantly correlated with lymph node metastasis,distant metastasis,and recurrence(P=0.007, 0.035,0.035,respectively).However,CTCs were not significantly correlated with sex,age,tumor location,TNM staging,and tumor differentiation(P＞0.05).Conclusion:CTCs were associated with poor prognosis of gastric cancer.

gastric cancer,circulating tumor cells,CK19,recurrence,density gradient centrifugation

10.3969/j.issn.1000-8179.20141410

天津医科大学第二医院消化内科（天津市300211）

*本文课题受天津医科大学科技基金项目（编号：2008ky28）和天津市高等学校科技发展基金计划项目（编号：20110130）资助

李熳 13512003455@163.com