miR-30通过调节CD90表达抑制肝细胞肝癌

李 培 李 莲 郭 燕 郑 红 宋丰举 刘 奔 陈可欣

miR-30通过调节CD90表达抑制肝细胞肝癌

李 培①②李 莲①郭 燕①郑 红①宋丰举①刘 奔①陈可欣①

目的：miRNA能通过转录后调节靶基因的表达量，并在致癌过程中发挥抑癌或促癌作用。研究发现miR-30家族在人类肿瘤中起着重要作用，并参与维持干细胞特性的上皮细胞间质化过程，本研究主要识别miR-30家族与肝细胞肝癌的关系。方法：应用qRT-PCR实验方法检测93例肝细胞肝癌患者癌组织和癌旁正常组织中miR-30c，miR-30b和miR-30e表达水平，另对121例肝细胞肝癌患者癌组织进行miR-30家族的表达及CD90免疫组织化学表达检测，分析miR-30家族与CD90在肝细胞肝癌中的相关性。结果：本研究发现miR-30c（P＜0.001）、miR-30b（P=0.004）和miR-30e（P＜0.001）与癌旁正常组织相比，癌组织中表达显著下调。CD90蛋白在癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织（P=0.007）。MiR-30c（P=0.032）和miR-30e（P=0.015）在CD90阴性表达的患者中表达水平显著高于CD90阳性表达的患者。结论：miR-30家族在肝细胞肝癌中可作为抑癌miRNA，并通过调节CD90蛋白来发挥这一作用。

肝细胞肝癌 miR-30家族 CD90 肿瘤干细胞 上皮细胞间质化

微小核糖核酸（miRNA）是一类机体内源性、大小为22个核苷酸的非编码小分子RNA，常在人类肿瘤中异常表达。miRNA通过结合mRNA3'-UTR区域调节蛋白的表达，并可以促进其降解或抑制其转录［1］。miRNA参与多种细胞生物学过程，如细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、血管形成和干细胞行为等［2-4］，在肝癌等多种肿瘤组织中存在异常表达［5-7］。肝癌居全世界肿瘤发病率第五位，死亡率第三位［8］。肝细胞肝癌是原发性肝癌中最主要的病理类型，疾病负担占总体肝癌负担的70%～85%。近期研究发现miRNAs在肿瘤的发生中起抑制作用或促进作用［9］。

miR-30家族已被证明在多种肿瘤中低表达，包括卵巢癌、神经胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌和口腔鳞状细胞癌［10-11］。miR-30家族与肝细胞肝癌的相互关系鲜有报道［12］。miR-30d通过结合靶基因Galphai2促进肝癌细胞的迁移和肝内、肝外远端肺转移［13］。研究发现miR-30a-3p在肿瘤组织中异常表达与癌旁正常组织相比差异具有统计学意义［14］。近期研究发现miR-30家族通过结合靶基因Snail1而抑制TGF-β 1诱导的上皮细胞间质化过程［15］。Snail1在上皮细胞间质化过程发挥重要作用，上皮细胞间质化过程是致癌的关键过程，且能维持干细胞的“干细胞性”［16-17］。研究表明上皮细胞质化过程中细胞获得类似干细胞特征并且表达干细胞的指标［18］。CD90是肝癌干细胞的一个重要标志物，参与多种生物过程，包括细胞黏附、肿瘤生长、转移和细胞凋亡等［19］。研究发现CD90阳性干细胞在肝细胞肝癌中起重要作用［20］。在另外一项全面的功能研究中，CD90表达在与癌旁正常组织和肝硬化组织相比，肿瘤组织中表达量显著升高［21］。这些结果提示miR-30在肝癌的发生发展中起关键作用，并且miR-30可能通过结合在Snail1的3'-UTR对CD90蛋白的表达起调控作用。然而，截至目前，关于miR-30c研究，miR-30b和miR-30e与肝细胞肝癌发生发展的相关性及这些miRNAs与肝癌干细胞的关系的研究尚鲜见。本研究通过分析miR-30c、miR-30b和miR-30e在癌组织和癌旁正常组织中表达水平确定miR-30家族在肝细胞肝癌中的作用，并通过评价miR-30家族与CD90蛋白的相互关系探索miR-30家族与CD90蛋白在肝细胞肝癌中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 为2003年1月至2012年12月于天津医科大学肿瘤医院行肝癌根治术，经病理学专家确诊为肝细胞肝癌患者，收集癌组织和癌旁正常组织93例迅速放置于液氮中冷冻，并放置于-80℃冰箱中备用。临床病历由经培训的护士搜集，包括患者一般人口学信息、诊疗经过、行为因素、生活习惯、环境因素和临床信息。本研究经天津医科大学肿瘤医院伦理委员会认可。

1.1.2 试剂 总RNA提取试剂Trizol microRNA,microRNA逆转录试剂盒，universal master mixⅡ,microRNA探针购自美国应用生物系统公司。CD90蛋白为抗-CD90多克隆兔抗原稀释浓度1：100购自美国百奇生物公司，二氨基联苯胺盐酸盐购自美国丹科公司和复染剂苏木精购自荷兰Klinipath公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 在液氮中研磨组织，利用Trizol法提取组织总RNA，采用Nanodrop进行浓度检测；1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA是否降解；稀释至工作液浓度（50 ng/μL），-80℃保存。

1.2.2 miRNA表达分析定量 RT-PCR依据美国生命科技公司提供操作流程进行，每个样本进行3个平行试验。组织RNA经逆转录16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min，获得的模板cDNA加入到PCR反应体系。实时定量PCR反应条件为：95℃，10 min；95℃，15s；60℃，1 min；40个循环。RT-PCR在7900HTFast实时PCR384-模块系统进行（AppliedBiosystems，USA）。miRNA相对定量采用循环阈值（CT）进行计算，选取RNU6snRNA的循环阈值进行标准化，去除变异＞5%的结果，miRNA表达结果为lg2-△△Ct：△Ct=（CttargetmiRNA-CtRNU6），lg2-△△Ct=lg2-（△Ct-△Ctmean）。

1.2.3 组织芯片的建立 免疫组织化学实验和评分肝细胞肝癌组织切片做HE染色由病理专家阅片确定肿瘤组织。组织芯片应用“TMA Builder”（G Szekeres，#WO 2004/000992，Histopathology Ltd，Hungary）以直径为0.6 mm打洞针在每个病例肿瘤区域获取组织核而组建。免疫组织化学采用的蜡块包埋厚度为4 mm。经过脱蜡和水化后，0.3%过氧化氢溶液孵育20 min以封闭内源性氧化物酶。PBS缓冲液浸泡清洗3次，滴加抗-CD90兔多克隆一抗（稀释浓度为1：100），置于4℃过夜。然后滴加二氨基联苯胺盐酸盐和复染剂苏木精进行孵育。

CD90以细胞浆和（或）细胞核呈棕黄色者为阳性细胞，光镜下于高倍镜下（×400）随机取5个不同视野，计算阳性细胞数，CD90结果采用半定量方法进行评分。染色程度分别为0分，阴性；1分，染色弱；2分，染色中度；3分，染色强；以阳性细胞数＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。最终CD90得分由染色程度和阳性细胞数相乘获得，0～3分为阴性表达，4～12分为阳性表达。

1.3 统计方法

全部资料采用SPSS17.0和Graphpad Prism 5.0软件进行分析。miRNA表达量在癌组织和癌旁正常组织差异分析应用配对t检验。CD90蛋白在癌组织和癌旁正常组织表达差异分析应用两相关样本非参数检验。miRNA与蛋白相关性分析应用独立样本t检验。所有统计检验均为双侧概率检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-30表达结果

本研究纳入的93例肝细胞肝癌患者一般人口学和临床特征见表1。经统计分析癌组织和癌旁正常组织中miR-30c、miR-30b和miR-30e发现，癌组织中miR-30c（P＜0.001）、miR-30b（P=0.004）和miR-30e（P＜0.001）表达下调（表2）。本研究对miR-30c，miR-30b和miR-30e与一般人口学和临床特征相关性分析发现，miR-30c在吸烟和饮酒患者中表达量下调；miR-30b在吸烟患者和血清AFP阳性患者中表达下调；miR-30e在吸烟患者、血清AFP阳性表达和HBV感染的患者中表达下调。未发现miR-30与性别、年龄、肿瘤个数、肿瘤大小和临床TNM分期的相关性。

表1 93例和121例肝细胞肝癌患者一般人口学特征和临床特征Table 1 Baseline and clinical characteristics of 93 and 121 HCC patients

2.2 CD90表达结果

本研究应用免疫组织化学方法对CD90在121例肝细胞肝癌癌组织和癌旁正常组织的表达进行评价。121例肝细胞肝癌患者一般人口学和临床特征见表1。在121例患者中，72例（58.5%）癌组织和51例（41.5%）癌旁正常组织中CD90阳性表达，CD90在癌组织和癌旁正常组织中表达差异具有统计学意义（P=0.007，表2）。本研究分析了CD90蛋白与一般人口学特征和临床特征的关系，发现CD90蛋白表达量与吸烟情况有临界关系，但差异无统计学意义（P= 0.076）。未发现CD90与年龄、性别、BMI、饮酒情况、肿瘤个数、肿瘤大小、TNM分期、血清AFP浓度和乙型肝炎病毒表面抗体状况相关性（表3）。

表2 miR-30家族和CD90表达情况Table 2 The expression of miR-30 family and CD90

图1 CD90蛋白免疫组织化学结果 （SP×400）Figure 1 Expression level of CD90 protein in tissue microarray by immunochemistry(SP×400)

2.3 miR-30表达与CD90蛋白表达相关性分析

CD90阴性表达的患者中miR-30家族均是高表达，CD90蛋白阳性表达的患者中miR-30家族均是低表达，miR-30c和miR-30e表达差异有统计学意义（miR-30c：P=0.032，miR-30e：P=0.015）；miR-30b表达差异无统计学意义（P=0.219，表3）。

表3 CD90蛋白肝癌组织中表达与患者一般人口学和临床特征的关系Table 3 The expression patterns of CD90 protein in tumor tissues stratified by baseline and clinical characteristics from 121 HCC patients

3 讨论

本研究探讨了miR-30家族与CD90在肝细胞肝癌中的表达情况。并将进一步讨论一下发现：1）miR-30c，miR-30b和miR-30e在癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织具有统计学意义；2）CD90在癌组织中的表达水平与癌旁正常组织差异具有统计学意义；3）miR-30c和miR-30e在CD90蛋白阴性表达和阳性表达患者中表达差异具有统计学意义。

研究发现miRNA可以调控多种基因的转录，并可以调节蛋白的表达［12］。miR-30家族共享相同的种子区域序列，分别是由位于1号染色体、6号染色体和8号染色体的6个基因编码［22］。miR-30参与多种生物过程，并且在卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤类型中表达异常［11，17］。miR-30在肝细胞肝癌中抑癌或促癌作用的研究相对较少。本研究发现miR-30c，miR-30b和miR-30e表达水平在癌旁正常组织与癌组织相比，癌组织中其表达显著降低。

近期研究结果证实miR-30家族通过结合Snail1mRNA3'TUR区域调控其表达水平［15］。Snail1在肝癌不同肿瘤干细胞表型中表达存在差异［23］。目前在肝细胞肝癌不同的细胞系和标本中，已经识别出多种具有干细胞样特征的标志物，其中包括CD133、CD44、CD90、OV6、EpCAM和CD13［24］。CD90参与多种生物学过程，包括细胞黏附作用、肿瘤生长、肿瘤转移和细胞凋亡等［19］。本研究中，CD90在癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织中的表达水平，表明CD90蛋白在肝细胞肝癌中具有重要作用。还发现miR-30表达水平与CD90蛋白的表达存在呈负相关，证明miRNA在调节肿瘤干细胞的功能上发挥不可或缺的作用［25］。目前确定的调节肝癌干细胞的功能的信号通路有Wnt、AKT、TGF-β和STAT3［26］。并且已有报道miR-30通过直接结合Snail13'TUR区域抑制TGF-β诱导的上皮细胞间质化作用［15］。综上所述，本研究认为miR-30结合Snail1 3'TUR区域通过TGF-β信号通路调节CD90蛋白的表达。

血清AFP浓度作为肝细胞肝癌的诊断标志物已经40多年。本研究发现miR-30c，miR-30b和miR-30e在肿瘤组织中低表达与血清AFP浓度增加具有相关性，提示miR-30在肝细胞肝癌中的诊断价值。这一结果需要更多的研究来证明。

总体而言，本研究发现miR-30c、miR-30b和miR-30e表达水平在癌旁正常组织与癌组织相比，后者中其显著降低，并且miR-30表达水平与CD90蛋白在TMA中表达水平呈负相关。以上发现提示miR-30通过直接结合靶基因Snail1调节CD90表达，可能在抑制肝细胞肝癌中发挥重要作用。

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（2014-05-09收稿）

（2014-08-10修回）

（本文编辑：周晓颖）

李培 专业方向为流行病与卫生统计学专业。

E-mail：lipei19862011@163.com

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miR-30 functions as a tumor suppressor by modulating CD90 in hepatocellular carcinoma

Pei LI1,2,Lian LI1,Yan GUO1,Hong ZHENG1,Fengju SONG1,Ben LIU1,Kexin CHEN1

Kexin CHEN;E-mail:chenkexin@tijmu.edu.cn
1Department of Epidemiology and Biostatistics,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,The Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China;2Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:miRNA can post-transcriptionally regulate the expression of target genes and act as oncogenes or tumor suppressor genes in tumorigenesis.Emerging evidence demonstrates that the miR-30 family may perform an important function in human cancers and can regulate epithelial-mesenchymal transition,which has a critical role in cancer stem cells.This research was conducted to identify the possible association between the miR-30 family and hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:The expression of miR-30c,miR-30b,and miR-30e in 93 tumor tissues and adjacent tissues were measured by real-time reverse transcription PCR.Furthermore,121 tumor tissues from an independent cohort were selected to measure the expression level of miR-30 family and CD90 by immunohistochemistry.The relationship between miR-30 family and CD90 protein expression was analyzed.Results:The expression levels of miR-30c(P＜0.001),miR-30b(P=0.004),and miR-30e(P＜0.001)were significantly decreased in tumor tissues compared with adjacent tissues,and the expression level of CD90 in tumor tissues was significantly higher than that in adjacent normal tissues(P= 0.007).In addition,the expression levels of miR-30c(P=0.032)and miR-30e(P=0.015)were significantly high in negative staining for CD90 when compared with positive staining for CD90.Conclusion:Taken together,we suggest that the miR-30 family may act as a tumor suppressor in HCC development and may modulate CD90 protein expression.

hepatocellular carcinoma,miR-30 family,CD90,cancer stem cell,EMT

10.3969/j.issn.1000-8179.20141389

①天津医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所肿瘤分子流行病与生物统计研究室，国家肿瘤临床研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）；②天津医科大学研究生院

陈可欣 chenkexin@tijmu.edu.cn