大豆异黄酮对骨质疏松大鼠种植体骨结合疗效的评价*

张春光 晁 洋 宋 扬 王慧媛 高菊荣

骨质疏松症是一种以全身骨量减少、骨组织破 坏为特征而导致骨脆性增加、骨折发生率增高的全身性骨骼疾病。尤其在绝经期后妇女中，这种原发性的骨质疏松症已成为影响妇女健康的严重问题。雌激素水平降低，骨的快速丢失导致骨质疏松症，是绝经后骨质疏松发病的重要原因。绝经后妇女骨质疏松发病率是同龄男性的6 倍，而骨质疏松又是口腔种植的相对禁忌症。因此，促进骨质疏松症患者种植体骨结合成为广大科研和临床工作者的研究目标。去卵巢大鼠是模拟绝经后妇女骨质疏松最成熟的动物模型[1]，本研究选取4 月龄的雌性SD 大鼠进行卵巢切除造成骨质疏松症大鼠模型，并使用大豆异黄酮这种对绝经期后骨质疏松症治疗广泛使用的药物，比较不同剂量的大豆异黄酮对骨质疏松症大鼠的种植体骨结合的影响， 以大鼠种植体骨结合率、松质骨螺纹区骨面积为指标，采用骨组织形态计量学手段，来研究不同剂量的大豆异黄酮对骨质疏松状态下种植体骨整合的影响，并使用抗扭力脱位测试种植体骨结合的实际效果，为其临床应用提供依据。

1. 材料与方法

1.1 实验用品及仪器 纯钛种植体：5mm×2mm 螺纹柱状光滑纯钛螺钉(西安中邦钛制品有限公司)；大豆异黄酮(陕西锦泰生物工程有限公司)；扭矩测试仪(HP-10，广东质信电子有限公司)；微型马达(LX-30FS，日本)；Olympus 多功能显微镜(TPH4-200，日本)；专业图像分析软件(Image-pro Plus 版本6.0)。

1.2 实验方法

1.2.1 骨质疏松动物模型的建立 4 月龄SD雌性大鼠，戊巴比妥钠麻醉后，在无菌条件下行双侧卵巢切除手术。经腹背部肋缘下1cm，脊柱两侧各1.5cm 交界处，分别做1cm 左右切口进入腹腔，结扎并切除双侧卵巢，术后肌注40 万单位青霉素预防感染。假手术组不切除卵巢，只切除卵巢附近少量脂肪组织。

1.2.2 种植手术 卵巢切除手术后10 周，对所有实验动物进行种植手术。戊巴比妥钠麻醉后，在大鼠双侧股骨远中干骺端分别植入纯钛螺纹钉1颗。

1.2.3 标本的获取 于种植手术后12 周处死实验大鼠，取其股骨远中段包含种植体的骨组织，用10%甲醛溶液固定送检。

1.3 实验动物及分组 4 月龄SPF 级雌性SD 大鼠40 只，由第四军医大学实验动物中心提供。饲养环境为清洁级，每5 只大鼠分一笼，室温25℃，相对湿度60%-80%，自由饮食。按照大鼠体重排序后随机区组分组方式共分为4 组：

Ⅰ，假手术组(Sham-ovariectomized rats，SHAM)：10 只，切除双侧卵巢旁等量脂肪组织后即缝合创口，未植入钛螺纹钉。

Ⅱ，卵巢切除组(OVX)：10 只，行双侧卵巢切除手术。10 周后在实验动物双侧胫骨干骺端分别植入钛螺纹钉1 颗。

Ⅲ，卵巢切除+ 低剂量大豆异黄酮组(OVX+SIL)：10 只，行双侧卵巢切除手术。10 周后在实验动物双侧胫骨干骺端分别植入钛螺纹钉1颗。植入钛螺纹钉后使用SI 药物灌胃12 周，灌胃剂量为60mg/ kg。

Ⅳ，卵巢切除+ 高剂量大豆异黄酮组(OVX+SIH)：10 只，行双侧卵巢切除手术。10 周后在实验动物双侧胫骨干骺端分别植入钛螺纹钉1颗。植入钛螺纹钉后使用SI 药物灌胃12 周，灌胃剂量为120mg/ kg。

1.4 检测指标及方法 实验开始第20 周后，处死全部大鼠并取材。每只实验大鼠左侧股骨样本进行生物力学扭矩测试，右侧股骨样本进行硬组织切片染色后行骨组织形态计量学检测。

1.4.1 生物力学扭矩测试 将带种植体的左侧胫骨标本，修整为15mm 长，使其能恰当卡入扭矩测试仪特制的夹具，扭力扳手固定在种植体头部外露部分。沿逆时针方向用力，记录种植体脱位松动前的最大载荷值。

1.4.2 骨组织形态定量学检测 将带种植体的右侧胫骨标本，送样进行非脱钙骨硬组织切片，将切片进行亚甲基蓝-碱性品红染色后常规封片。将染色切片置于显微镜下进行观察并拍照，使用Image-pro Plus 软件在大倍率视图下：①标出种植体外形轮廓线，测量轮廓线中有骨结合的部分的长度和总长度，计算出种植体骨结合率(Bone Contact Ratio of the implant，BCR)。②标出种植体的两个螺纹外形最外点，以该两点相连的长度为边长向骨内区域画出一正方形，计算该区域面积中矿化骨基质的面积所占百分比，计算出松质骨区骨量(Trabercular Area，TA)。

1.5 统计学方法 多标本均数间的比较采用随机区组设计资料的方差分析，计算结果以±s形式表示，检验水准α=0.05，P＜0.05 有统计学意义。使用SPSS 16.0 软件进行统计分析。

2. 结果

2.1 实验大鼠状况 去卵巢手术、种植体植入手术后至处死前，各组大鼠状况均良好，卵巢切除及种植术后，所有大鼠创口愈合佳，无感染。

2.2 种植体生物力学扭矩测试 OVX+SIH组的脱位扭矩与SHAM 组无显著性差异(P＞0.05)。其余各实验组扭矩值均较SHAM 组低，且P＜0.05(见表1)。

2.3 骨组织形态定量学检测 SHAM 组及OVX+SIH 、OVX+SIL 组的松质骨区骨量、骨结合率均明显高于OVX 组，比较差异有显著性(P＜0.05)。其中，OVX+SIH 组的松质骨区骨量、骨结合率均比OVX+SIL 组高，比较差异有显著性(P＜0.05)(见表2)。

2.4 光镜下观察种植体-骨结合组织切片形态 SHAM 组皮质骨区的种植体骨结合界面骨板密集，骨与种植体结合紧密。松质骨区种植体表面包绕骨质较厚，连续性较好。松质骨区骨小梁密集而连续，粗细均匀成网状(见图1A)。

OVX 组皮质骨区种植体骨结合界面骨板较薄，连续性较差。松质骨区种植体表面大部分在骨髓腔内未与骨组织接触，周围有少量成团的矿化组织，骨小梁稀疏(见图1B)。

OVX+SIH、OVX+SIL 组皮质骨区种植体骨结合界面紧密接触，结合骨板连续性较好。松质骨区包绕种植体的骨板厚度增加，排列成板状。骨松质区骨小梁比较粗大基本连接成网状，介于以上两组之间。OVX+SIL 与OVX+SIH 比较，皮质骨区未见明显区别，但骨小梁区排列欠规则，骨小梁较薄(见图1C、D)。

表1 各组大鼠种植体脱位扭矩分析(N·cm)(±s，n=10)

表1 各组大鼠种植体脱位扭矩分析(N·cm)(±s，n=10)

注：△与OVX 组比较P＜0.05； ▲与OVX+SIL 组比较P＜0.05；☆与sham 组比较P＞0.05

组别 脱位扭矩 扭矩范围Sham 组 21.2±3.5 18～24 OVX 组 12.5±2.7 9～15 OVX+SIL 组 16.6±3.1△ 13～20 OVX+SIH 组 19.8±2.9▲☆ 17～22

3. 讨论

越来越多的老年骨质疏松症患者寻求种植牙修复缺失牙齿，但骨质疏松症患者种植牙的高失败率使大量患者的需求难以满足。国内外目前的研究显示，骨质疏松症对口腔种植的影响主要表现在种植区骨量减少、骨质量变差和降低种植体骨结合率这两方面。

表2 各组大鼠种植体骨结合情况(%)(±s，n=10)

表2 各组大鼠种植体骨结合情况(%)(±s，n=10)

注：△与OVX 组比较P＜0.05；▲与OVX+SIL 组比较P＜0.05；☆与sham 组比较P＜0.05

组别 骨结合率 松质骨区骨量Sham 组 78.63±2.92 36.52±2.38 OVX 组 43.82±1.72 19.73±2.63 OVX+SIL 组 57.35±2.16△ 24.29±1.97△OVX+SIH 组 71.91±3.36▲☆ 32.83±1.64▲☆

图1 硬组织切片染色(×10)

国内外有许多学者实验证实，使用雌激素替代疗法可以使骨质疏松症动物体内的种植体的骨结合更加紧密，李晓红等[2]使用雌激素和钙制剂，对骨质疏松大鼠模型种植体界面骨愈合影响的实验显示出，骨质疏松症降低了种植体和骨界面的早期骨愈合程度，而雌激素治疗或者雌激素和钙联合治疗都能增加种植体周围骨的形成。虽然雌激素替代疗法对骨质疏松症有较好疗效，但其对乳腺和子宫等靶器官的不良影响也日益受到重视[3]。

大豆异黄酮由金雀异黄素(染料木黄酮)和大豆苷原两种类雌激素物质组成，是一种典型的植物雌激素[4]。其结构与雌激素相似，具有弱雌激素样作用，可防治骨质疏松症尤其是绝经期妇女的骨质疏松症[5]，且对乳腺、子宫等器官无不良影响[6]。国内外的流行病学调查发现，东方女性的膳食中豆类食物的比重远远大于西方女性，前者的骨折发生率也显著低于后者[7]。之后的很多研究把大豆异黄酮作为雌激素替代物防治绝经后骨质疏松症。Arjmandi 等[8]的研究报道大豆蛋白可抑制去卵巢模型大鼠的股骨及腰椎骨的骨密度降低， 并证实大豆异黄酮是大豆蛋白发挥抗骨质疏松作用的有效成分。Ishida 等[9]报道大豆异黄酮中DAI 和GEN 成分可有效防止骨质疏松模型大鼠股骨骨密度、强度、灰重及钙磷含量的下降。后来， Ishimi 等[10]研究发现GEN 可抑制OVX 小鼠的骨丢失而没有出现作用于子宫的雌激素样作用。

在本次实验动物中，OVX 组不仅种植体骨结合率、松质骨螺纹区骨面积低于SHAM 组，而且骨小梁形态很差，种植体周围结合骨板量非常少，从而减弱了骨组织对种植体的支持，使种植体的抗脱位扭矩与SHAM 组有较大差距。OVX+SIL 组组织学观察示：皮质骨区和松质骨区种植体都与较多的骨组织接触，只有部分与骨髓腔直接相连，达到了较好的骨结合状况。通过给药量的增加，OVX+SIH 组的组织学观察己经与SHAM 组相似，皮质骨区和松质骨区种植体都与矿化良好的板状骨组织紧密接触，种植体在骨髓腔部分也被骨板包绕，虽然骨计量学检测与SHAM 组相比有显著性差异，但通过生物力学扭矩测试，两组已无显著性差异，达到了良好的骨结合状况。

综合以上结果说明，大豆异黄酮有剂量依赖性地改善种植体周围骨质量的可能性，大豆异黄酮可以有效改善种植体周围骨质量，增强骨质疏松大鼠钛螺纹钉的骨结合强度，增强疏松状态下种植体的稳定性，并存在剂量依赖性。

[1] Kalu D N. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss[J]. Bone Miner， 1991，15(3):175-191

[2] 李晓红，任 辉，唐卫峰. 雌激素及钙剂对去势大鼠种植体界面骨愈合影响的相关研究[J]. 中国口腔种植学杂志， 2006，11(4):151-154， 157

[3] 瞿妙哥. 绝经后长期小剂量激素替代疗法对子宫的影响[J]. 中国医药导报， 2010，7(13):35-36

[4] Wang H， Murphy P A. Isoflavone Composition of American and Japanese Soybeans in Iowa: Effects of Variety， Crop Year， and Location [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1994，42(8):1674-1677

[5] 王龙梓，刘兆平，张岫美. 大豆异黄酮雌激素样作用与骨质疏松的防治[J]. 中国生化药物杂志， 2005，26(5):312-314

[6] Huber J， Imhof M， Schmidt M. Effects of soy protein and isoflavones on circulating hormone concentrations in preand post-menopausal women: a systematic review and meta-analysis[J]. Hum Reprod Update， 2010，16(1):110-112

[7] Lau E M， Lee J K， Suriwongpaisal P， et al. The incidence of hip fracture in four Asian countries: the Asian Osteoporosis Study (AOS)[J]. Osteoporos Int， 2001，12(3):239-243

[8] Arjmandi B H， Birnbaum R， Goyal N V， et al. Bone-sparing effect of soy protein in ovarian hormone-deficient rats is related to its isoflavone content[J]. Am J Clin Nutr， 1998，68(6 Suppl):1364S-1368S

[9] Ishida H， Uesugi T， Hirai K， et al. Preventive effects of the plant isoflavones， daidzin and genistin， on bone loss in ovariectomized rats fed a calcium-deficient diet [J]. Biol Pharm Bull， 1998，21(1):62-66

[10] Ishimi Y， Arai N， Wang X， et al. Difference in effective dosage of genistein on bone and uterus in ovariectomized mice[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000，274(3):697-701