2型糖尿病患者外周血CD146 mRNA变化及意义

张普宏，冯 钢，高家林，浦 春，章 尧

(1.皖南医学院 临床检验诊断学教研室，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院附属弋矶山医院 内分泌科，安徽 芜湖 241001；3.皖南医学院 生物化学教研室，安徽 芜湖 241002)

糖尿病患者心血管并发症是引起患者死亡的主要原因，而血管内皮细胞功能紊乱和损伤在糖尿病血管病变的发病中扮演着关键角色[1-3]。研究表明高血糖可增强氧化应激作用及减少抗氧化作用而导致血管内皮细胞的损伤和功能紊乱[4]。高血糖引起的糖基化终末产物可中断血管内皮细胞分裂周期，抑制细胞增殖及促进细胞凋亡[5-7]。由于外周血中的血管内皮细胞来源于活化或损伤的血管内皮，循环内皮细胞(CECs)的增多可出现在血管损伤等多种病理情况下，如心血管疾病，感染性脉管炎和2型糖尿病等[8-10]，因此CECs被认为是一种血管损伤的标志物[11]。

CD146最初从黑色素瘤细胞中发现，是一种Ca2+非依赖性细胞粘附分子，属于免疫球蛋白超家族(Igsf)成员，表达于血管内皮细胞及多种恶性肿瘤。CD146参与细胞与细胞间的局部粘连、聚集、细胞骨架的重组、细胞形态结构的维持，以及调控细胞游走和增殖等过程。多项研究发现，外周血中表达CD146的细胞主要为淋巴细胞以及CECs[12-16]。本研究旨在通过定量检测外周血CD146 mRNA评估2型糖尿病患者血管内皮细胞损伤，探讨2型糖尿病患者外周血CD146 mRNA水平和血管内皮细胞损伤、氧化应激、血糖控制等指标间的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究包括48例2型糖尿病患者和32例正常对照者。2型糖尿病患者的诊断标准参照美国糖尿病协会(ADA)糖尿病诊断指南2010(HbA1c≥6.5%)[17]。正常对照者没有明显用药史，空腹及餐后血糖正常。排除标准包括：未控制的高血压(BP>140/90 mmHg),活动性炎症，感染性疾病，动脉粥样硬化病史(冠心病，周围性血管疾病，颈动脉性疾病)，服用扰乱血管内皮细胞功能的药物，如阿司匹林、降血脂药物、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂，吸烟，妊娠，哺乳期[18]。

1.2 实验方法

1.2.1 可溶性E选择素(sE-selectin)的测定 采用ELISA法测定血浆可溶性E选择素浓度，操作严格按照试剂盒说明书(R&D)进行。

1.2.2 谷胱甘肽(GSH)的测定 按照Hu等描述的方法测定血浆GSH的浓度[19]。血浆加入Tris-EDTA混匀后在412 nm吸光度处测定，测定值标记为A1。然后，在混合物中加入二硫代二硝基苯甲酸，暗箱孵化15 min后在412 nm吸光度处测定，测定值标记为A2。按照公式(A2-A1)×1.57计算出GSH的值，单位为μmol/L。

1.2.3 RNA的提取 采用QIAamp RNA Blood Mini Kit(Qiagen)从新鲜的全血中提取总RNA。严格按照说明书操作，用核酸定量仪测定提取总RNA浓度,A260/A280比值在 1.8～2.0,-80℃保存备用。

1.2.4 mRNA的测定 采用SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)，将经DNA酶处理后的RNA(100 ng)反转录(RT)为cDNA并保存于-20°C。用Oligo Primer Analysis Software v.7软件设计CD146基因引物，上游：5′-CCTGGAACGTCAACGGCAC-3′,下游：5′-GGGTGGGTTAAATTGACCAGCTCC-3′，扩增产物长度177 bp，Tm 52°C。内参beta-actin基因引物，上游：5′ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′，下游：5′-CTCATTGCCAATGGTGAT-3′，扩增产物长度180 bp，Tm 53°C。PCR采用ROCHE LightCycler 480-II扩增仪，反应体系中包含100 ng引物及12.5 μl SYBR Green PCR混合液(QIAGEN)，总体积25 μl。PCR程序如下：95°C 10 s、94°C 5 s、58°C 15 s、72°C 15 s，40个循环；72°C 30 s。产物溶解曲线分析程序为95℃ 15 s,60℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用Relative Quantification检测模式，软件分析结果。

2 结果

2.1 2型糖尿病组和正常对照组临床指标的比较 2型糖尿病组和正常对照组的年龄、性别和血压的差异无统计学意义。2型糖尿病组外周血CD146 mRNA水平和血浆sE-selectin浓度显著高于对照组(P<0.01)；而2型糖尿病组GSH明显低于对照组(P<0.01)，见表1。

表1 2型糖尿病组和正常对照组临床指标比较Tab 1 Clinical indicators measured in the T2DM patients and healthy

2.2 CD146 mRNA与临床指标的相关性 CD146 mRNA 和 HbAlc呈正相关(r=0.639 5,P<0.05;图 1)， CD146 mRNA 和 sE-selectin也呈正相关 (r=0.658 0,P<0.05;图 2)，而CD146 mRNA 和 GSH之间未发现存在相关性。

3 讨论

血管内皮细胞功能紊乱是导致糖尿病患者血管病变的重要原因之一，因此准确评估血管内皮细胞功能紊乱对于降低糖尿病患者心血管并发症具有重要的临床意义。血浆sE-selectin是血管内皮细胞释放的一种细胞粘附分子，sE-selectin可用于血管内皮细胞功能紊乱及损伤程度的评估。我们发现2型糖尿病患者血浆sE-selectin浓度显著高于正常对照者，证明2型糖尿病患者存在血管内皮细胞的损伤，与文献结果一致[20]。2型糖尿病患者血管内皮细胞的损伤和功能紊乱与高血糖引起的氧化应激作用增强和抗氧化作用减低相关。GSH作为一种抗氧化剂，可阻止氧自由基对细胞内重要结构的损伤，我们的研究也证实了2型糖尿病患者GSH显著低于正常对照者[21-22]。

Lombardo等发现2型糖尿病并不影响患者的骨髓动员，但是可显著减少成熟骨髓内皮祖细胞(EPCs)的数量，而成熟EPCs数量的改变可导致内皮细胞的损伤，引起外周血CECs增多[23]。Kotb等发现CECs参与了2型糖尿病患者心血管病变等过程，证明CECs是一种2型糖尿病患者血管内皮细胞功能紊乱及疾病控制情况的标志物[24]。

CD146表达于血管内皮细胞中，参与细胞间的局部粘连、聚集、细胞骨架的重组和细胞形态结构维持等过程[25-26]。在正常对照者外周血中，CD146 mRNA主要来源于淋巴细胞。由于高血糖增强了氧化应激作用、减少了抗氧化作用而导致血管内皮细胞损伤和功能紊乱，因此在2型糖尿病患者外周血中，除了淋巴细胞，CECs也是CD146 mRNA的重要来源。我们的实验结果证明了2型糖尿病组外周血CD146 mRNA水平显著高于正常对照组。

Lorenzi等发现持续性高糖血症可明显延长血管内皮细胞的细胞周期，导致血管内皮细胞功能紊乱及损伤[27]。在2型糖尿病患者中，相关分析发现CD146 mRNA和HbA1c明显相关，表明血糖控制不佳的2型糖尿病患者血管内皮细胞功能紊乱和损伤的程度较重，并且相关分析还发现CD146 mRNA和sE-selectin也存在明显的相关性。由于GSH减低加重血管内皮细胞损伤主要是通过导致血管内皮细胞凋亡，因此，在2型糖尿病患者中，相关分析未发现CD146 mRNA和GSH之间存在显著的相关性。

综上所述，通过测定2型糖尿病患者外周血CD146 mRNA水平可评估血管内皮细胞功能紊乱和损伤程度，外周血CD146 mRNA可能是血管内皮细胞功能紊乱和损伤的生物标记物。

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