芝麻素对AlCl3及D-半乳糖所致大鼠肝损伤的保护作用

赵梦秋，郑书国，杨解人，姚 海，王 欢，李 伟，宣佳利，张俊秀

(皖南医学院 药理学教研室，安徽 芜湖 241002)

D-半乳糖可引起肝损伤，可用于建立肝损伤动物模型[1]。一方面，它作为肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，竞争性生成二磷酸尿苷半乳糖复合物，使磷酸尿苷耗竭，导致物质代谢障碍；另一方面，通过加速自由基生成，诱发脂质过氧化反应[2]。铝是我们生活中经常会接触到的一种慢性蓄积性毒性金属元素，尤其因为国人的饮食习惯，如油条、蛋糕、膨化食品以及各种铝制品的使用会导致铝摄入超标，大量研究表明铝对机体的损害与脂质过氧化反应增强有关。铝中毒对神经系统的毒性已被许多研究所证实，其对于肝脏损伤亦有报道[3-5]，因此本实验使用肝损伤诱导剂D-半乳糖联合三氯化铝，复制肝损伤模型。

芝麻素是芝麻中主要活性成分，具有较强抗氧化活性，能降低NAPDH氧化酶的表达[6]，同时提高SOD的活性[7]，对氧化应激相关性疾病具有明显防治作用[8-9]。前期研究发现芝麻素与维生素E联用时具有协同作用[10]。本实验通过连续灌胃给予三氯化铝联合腹腔注射D-半乳糖法建立大鼠肝损伤模型，观察芝麻素及其与维生素E联用对肝损伤的保护作用并初步探讨其可能机制，为临床应用芝麻素防治肝损伤提供依据。

1 材料

1.1 实验动物及饲养条件 清洁级SD大鼠，体质量(200±20) g，雌雄各半。许可证号：SCXK(苏)2009-0002，购于苏州大学实验动物中心。大鼠分笼饲养，每笼一只，自然光照，室温(23±2)℃，相对湿度60%～65%，自由进食和饮水。

1.2 主要药物 芝麻素(sesamin，Ses)，纯度93.7%，上海纯优生物科技有限公司；维生素E，北大国际医院集团西南合成制药股份有限公司；三氯化铝(AlCl3)，国药集团化学试剂有限公司；D-半乳糖(D-gal)，Reanta Scientific Technology company；戊巴比妥钠，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要试剂 HE和Masson染色试剂:苏木精，伊红。Masson:染液试剂盒，南京建成生物工程研究所；免疫组化试剂:iNOS(诱导性一氧化氮合酶)抗体，二抗，封闭液，三抗试剂盒，DAB显色液，武汉博士德生物工程有限公司；T-AOC(总抗氧化能力)、SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)试剂盒，南京建成生物工程研究所；NO(一氧化氮)检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 动物分组及给药方法 30只大鼠随机分为正常对照组、肝损伤模型组、芝麻素(Ses)组、芝麻素维生素E联用组和维生素E组。除正常组外，其余各组大鼠采用D-gal[180 mg/(kg·d)]腹腔注射联合AlCl3[15 mg/(kg·d)]灌胃建立肝损伤大鼠模型，共12周。13周起各给药组分别灌胃给予芝麻素[160 mg/(kg·d)]、维生素E[10 mg/(kg·d)]，联用组给予芝麻素以及维生素E[160 mg/(kg·d)+10 mg/(kg·d)]共8周。正常对照组灌胃给予等容量0.5%羧甲基纤维素钠。期间每周称重一次，调整给药剂量。

2.2 肝脏组织HE及Masson染色 各组大鼠肝脏多聚甲醛固定，常规脱水、浸蜡、包埋，制成石蜡切片(5 μm)，切片常规脱蜡至水。HE染色，光镜下观察肝脏病理学变化。Masson染色步骤如下：石蜡切片脱蜡至水后，30～40 ℃温热水漂洗，每次60 s，共2次；核染液染色20 s，弃染色液，冲洗液冲洗30 s；浆染液染色30 s，弃染色液，冲洗液冲洗30 s；黄色分色液分色6 min，弃分色液；直接用蓝色复染液染色3 min，弃染色液，用无水乙醇冲洗干净；吹干后，封片，光镜下观察胶原纤维增生情况。

2.3 生化指标检测 肝脏用预冷的生理盐水冲洗，滤纸拭干，称湿质量后计算肝脏质量指数(肝脏湿质量/体质量)。称取0.1 g肝脏，制备10%组织匀浆，再以3 000 r/min离心10 min，取上清液(按照试剂盒说明书进行操作)检测T-AOC、SOD、MDA及NO。

2.4 肝脏组织iNOS蛋白表达检测 采用免疫组织化学方法，常规石蜡切片(5 μm)脱蜡至水，灭活内源性过氧化物酶后浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，微波热抗原修复，冷却后封闭。滴加一抗iNOS抗体(1∶150)，4 ℃冰箱过夜后依次滴加二抗，SABC，PBS洗3次，DAB显色。常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察，iNOS阳性产物呈棕黄色。应用Image-pro plus 5.0型全自动医学图像彩色分析系统进行图像半定量分析。每个标本选取6张切片，相同放大倍数下测定肝组织中阳性表达的棕黄色颗粒面积(Area)和累计光密度(IOD)，计算出平均光密度值(AIOD)值。

3 结果

3.1 芝麻素对大鼠一般状况的影响 正常对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷，毛色有光泽，饮食、饮水均正常，且无死亡现象发生；肝脏损伤模型组大鼠精神萎靡不振，反应迟钝，神情呆滞，毛发竖直无光泽，给予芝麻素和维生素E治疗后，大鼠上述症状均有不同程度缓解。造模前各组大鼠体质量无统计学差异(P>0.05)，实验结束时模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01)；药物治疗对体质量减轻的影响无显著性差异(表1)。

3.2 芝麻素对大鼠肝脏湿质量及肝脏质量指数的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏湿质量降低(P<0.01)；药物治疗对肝脏湿质量及肝脏质量指数无显著影响(表1)。

3.3 芝麻素对大鼠肝脏病理学改变的影响 HE染色结果显示，正常肝细胞呈条索状排列，规则有序，胞浆红染，胞核圆形蓝染。模型组出现明显肝细胞损伤，细胞内见大小不等的脂肪空泡，部分肝细胞胞浆淡染、疏松，肝索排列紊乱。给予芝麻素或维生素E后损伤明显减轻(图1)。Masson染色显示，正常组肝脏血管周围有少量纤维，呈蓝紫色，模型组肝脏胶原纤维自中央静脉区向汇管区延伸，在肝血窦大量沉积，治疗组纤维增生明显减少(图2)，提示芝麻素及维生素E可明显减轻三氯化铝合并D-半乳糖诱发的肝损伤及胶原沉积。

表1 芝麻素对大鼠体质量、肝脏湿质量及肝脏质量指数的影响Tab 1 Effects of sesamin on body weight,wet hepar weight and hepar index of

1.对照组,2.模型组,3.芝麻素组,4.芝麻素维生素E联用组,5.维生素E组

1.对照组,2.模型组,3.芝麻素组,4.芝麻素维生素E联用组,5.维生素E组

3.4 芝麻素对大鼠肝组织iNOS表达的影响 光镜下可见正常对照组肝脏iNOS有少量表达，主要集中于汇管区，中央静脉区较少，主要在肝细胞，胞浆显棕色。模型组与对照组相比表达明显增多，成块状甚至片状分布。各给药组阳性表达均明显减少，见表2。

表2 芝麻素对大鼠肝组织iNOS表达的影响Tab 2 Effects of sesamin on iNOS expression in liver of rats with liver

3.5 芝麻素对大鼠肝脏NO水平的影响 与正常组相比，模型组NO水平显著升高(P<0.01),各给药组NO水平均明显降低(P<0.05)，见图3。

3.6 芝麻素对大鼠肝脏T-AOC、SOD及MDA水平的影响 与正常对照组相比，模型大鼠肝脏T-AOC及SOD水平明显降低，MDA水平显著上升(P<0.01)；与模型组相比，芝麻素组与联用组T-AOC、SOD水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，各治疗组MDA水平均显著降低(P<0.05)，见表3。提示芝麻素与维生素E均可有效提高机体抗氧化能力。

a P<0.05 vs.Control；b P<0.05 vs.model

4 讨论

本实验采用AlCl3及D-gal联合造模12周，建立肝损伤模型，光镜下可见肝细胞空泡，胞浆淡染，肝索排列紊乱，胶原纤维大量沉积，说明模型组大鼠肝脏出现损伤，模型建立成功。给予药物治疗后，肝细胞损伤情况明显改善，胶原沉积减少，说明各治疗药物能够改善AlCl3及D-gal引起的肝损伤。

T-AOC水平可综合反映机体的抗氧化能力。SOD是自由基清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。MDA是脂质过氧化终产物，其含量可反映组织过氧化损伤程度。本研究显示，造模12周后，模型组大鼠肝组织T-AOC、SOD水平显著降低，MDA水平明显升高，提示大鼠肝脏出现过氧化损伤。给予芝麻素或维生素E后，大鼠肝组织T-AOC和SOD活性明显升高，MDA水平明显降低，提示芝麻素与维生素E均可明显提高大鼠肝组织抗氧化能力，减轻脂质过氧化损伤，这可能是减轻肝损伤、抑制肝组织胶原增生的主要机制之一。前期研究发现芝麻素与维生素E联用时具有协同抗氧化作用[11]，本实验发现芝麻素联用维生素E组对SOD水平的改善优于芝麻素组，但对肝细胞损伤及胶原沉积的改善无明显优势，其原因有待于进一步研究。

表3 芝麻素对大鼠肝脏T-AOC、SOD及MDA水平的影响Tab 3 Effects of sesamin on T-AOC,SOD and the content of MDA in hepatic tissues of rat

综上所述，芝麻素对AlCl3联合D-半乳糖所致肝损伤具有明显改善作用，其机制可能包括两方面因素，一是提高肝脏的抗氧化能力，减少氧化损伤；其次是下调iNOS表达，从而防止大量持续的NO对肝脏的损伤。

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