5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MLH-1基因甲基化状态、mRNA及蛋白表达的影响

葛 畅，许春伟，王鲁平，方 园，张玉萍

(中国人民解放军北京军区总医院 病理科，北京 100700)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)作为最常见恶性肿瘤之一，其发病率仅位于肺癌和前列腺癌(女性为乳腺癌)之后，居第3位，而每年CRC病死率约占全部恶性肿瘤死亡总人数的8%，在恶性肿瘤死因中居第4位[1]。CRC的发生与发展与癌基因和抑癌基因的缺失、扩增或突变有关。有些基因在染色质水平上发生表型遗传修饰改变也会导致表达下调。表型遗传修饰最多见的是CpG岛(CpG island)的甲基化改变。错配修复基因MLH-1 定位于人类染色体3p21.3～23，含19个外显子，全长约58 kb，其开放读码框(ORF)长2 268 bp，编码含756个氨基酸的蛋白质，是错配修复系统中最为重要的基因，其功能为调节细胞周期，使之阻滞于G2期，从而在染色体分离前，纠正错配的碱基，使DNA得以正确复制[2]。该基因缺陷可导致细胞在增殖过程中的错误掺入和缺失不能修复，造成高度微卫星不稳定(MSI-H)，随机突变率增高，引起一系列涉及细胞生长、分化、凋亡及癌转移的相关靶基因(如TGF-βⅡR、IGFⅡ和BAX等)继发性的突变改变，从而导致肿瘤的发生或转移[3]。研究发现，MLH-1启动子区高甲基化状态可能是此基因失活的一种重要机制[4]。本实验通过研究5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对HT-29和LoVo细胞株作用后MLH-1基因的DNA、mRNA和蛋白水平的改变进行初步探究，探讨肿瘤发生发展过程中MLH-1基因失活的甲基化机制及药物恢复MLH-1基因表达的可能性，以期寻找CRC的肿瘤标记物及新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo(北大医学部107实验室)；DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；核酸蛋白质浓度测量仪B-500(上海创萌生物科技有限公司)，DNA甲基化修饰试剂盒及甲基化阳性/阴性对照(美国ZYMO公司)；qPCR反应试剂ROX(TaKaRa公司)；Mix(上海辉睿生物科技有限公司)；Mx3000P定量PCR扩增仪(美国 Stratagene公司)；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(美国Sigma公司)，以DMSO溶剂充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分装后-80℃保存；MLH-1和内参β-actin(美国Santa Cruz公司)，Western blot相关试剂(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 细胞培养和干预 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μl/ml青霉素、链霉素的RPMI1640的培养基中常规培养，胰酶消化传代。取贴壁生长良好的的细胞以RPMI1640调整细胞密度至2×106/ml，接种于六孔培养板。干预的LoVo和HT-29细胞分别加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷混合培养液，每24h更换新鲜培养基，连续作用72h；以HT-29和LoVo分别加入等量DMSO溶剂培养作为对照。

1.3 Methylight方法 取对数生长期的HT-29和LoVo细胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)说明提取上述两种细胞不同浓度梯度的细胞DNA，用紫外分光光度仪(上海创萌生物科技有限公司)测DNA浓度，以DNA浓度在25ng/μl为最低浓度，使用DNA修饰试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰，按照试剂盒说明书操作，MLH-1基因甲基化引物按文献设计[5]，上游引物：5′-AACATATACAACGCATACCCACAA-3′，下游引物：5′-GTAAAGAAATATACGGTTTGCGGAAA-3′，探针：FAM 5′-CGCCGAATTCCCTAACGTACCAATCAAACC-3′ BHQ1，内参β-actin基因甲基化按文献设计[6]，上游引物：5′-TGGTCATCCAGGTTTAGTAACT-3′，下游引物：5′-AACCAATAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′，探针：FAM 5′-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3′BHQ1。PCR反应总体系为20 μl，2×Taq PCR Master Mix 10 μl；修饰后的DNA模板2 μl；上、下游引物各1 μl(10 pmol)；探针FAM 0.4 μl(10 pmol)；ROX 0.3 μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，共50个循环；72℃延伸5 min，4℃冷却5 min。经亚硫酸氢盐修饰的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作为阳性、阴性对照，水为空白对照。

1.4 实时荧光定量PCR分析结直肠癌细胞株LoVo和HT-29中MLH-1基因mRNA的表达情况 取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，胰酶消化后抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，行实时荧光定量PCR。MLH-1基因mRNA引物由Primer Premier 5.0软件设计，上游引物：5′-TCCCGAAAGGAAATGACT-3′，下游引物：5′-TGGCTTGTGGTGCTGAGTG-3′；内参基因GAPDH上游引物：5′-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3′，下游引物：5′-GGAGGGATCTCGCTCC-3′。20 μlPCR反应体系含10 μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl、0.3 μlROX Reference Dye(50×)、4.0 μlDNA模板、3.7 μl dH2O。反应条件为95℃预变性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40个循环；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。实验重复3次，取均值。扩增完毕后分析熔解曲线，采用2-△△Ct法分析MLH-1 mRNA表达。△△Ct=(Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)。

1.5 Western blot分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MLH-1蛋白的表达情况 取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，在上述两种细胞株各个浓度梯度的每管细胞中加入80 μl蛋白裂解和1 μl蛋白酶抑制剂PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃离心，10 min后取上清液提取总蛋白，BCA法蛋白定量。总蛋白100℃变性5 min后，配置浓度为12%的SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质电泳，蛋白电泳分离后经电转移槽转移至PVDF膜。BSA室温封闭2h后，PVDF膜置于1∶200稀释的MLH-1单克隆抗体稀释液中4℃冰箱内培养过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG稀释液中37℃培养2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL发光液显影，采集并分析处理图像。凝胶成像系统摄像并分析各条带吸光度值，以0.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷条带吸光度(A)值/β-actin条带吸光度(A)值为基准，设置为1。以目的基因条带吸光度(A)值/β-actin条带吸光度(A)值作为MLH-1蛋白的相对表达强度。实验重复3次，取均值。

1.6 结果判断标准 MethyLight结果判断标准[7]：同时扩增目的基因(MLH-1)和内参基因(β-actin)，根据标准曲线得到两者的原始拷贝数，计算标准甲基化指数(the normalized index of methylation,NIM)其定义为：NIM=[(MLH-1 sample/MLH-1 positive)/(β-actin sample/β-actin positive)]×100，其中MLH-1 sample指样本中甲基化MLH-1基因的拷贝数，MLH-1 positive指阳性对照中甲基化MLH-1基因的拷贝数，β-actin sample和β-actin positve与上述相同。NIM≥4为甲基化，NIM<4为非甲基化。

2 结果

2.1 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MLH-1基因甲基化状况 将阳性对照按10的倍数稀释成1～1×10-67个浓度梯度制作标准曲线(其拷贝数为103～109/ml)。各浓度梯度反应均做复孔。MethyLight的线性范围为104～108拷贝/ml，R2为0.998。实时荧光定量PCR得出数据按MethyLight结果判断标准，在DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组中HT-29和LoVo细胞株中MLH-1基因甲基化状态都为甲基化、甲基化、未甲基化和甲基化(表1)。

表1 HT-29和LoVo细胞株中MLH-1基因甲基化状况

2.2 结直肠癌细胞株LoVo和HT-29中MLH-1基因mRNA表达状况 实时荧光定量PCR得出的数据检验扩增效率(E)通过公式E=2-1/斜率-1计算，MLH-1基因mRNA为0.963，GAPDH基因mRNA为0.977，两个基因的扩增效率相差<5%，符合用2-△△Ct法相对定量分析条件。经2-△△Ct法分析并以对照组、各不同浓度实验分组为横坐标，将测出相应的平均相对定量比值为纵坐标绘出柱状图后发现0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷作用后，HT-29细胞株中MLH-1基因的mRNA表达水平较对照组上调，并且呈时间、药物浓度依赖性(F=8.918,P=0.010)，与对照组DMSO组比较1.0 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异(P<0.05)；LoVo细胞株中MLH-1基因的mRNA表达水平较对照组上调，并且也呈时间、药物浓度依赖性(F=8.351,P=0.011)，与对照组DMSO组比较1.0 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异(P<0.05，表2、图1)。

表2 HT-29和LoVo细胞株中MLH-1基因mRNA表达状况

2.3 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MLH-1蛋白表达状况 Western blot结果运用Image J软件进行条带图像分析，获得HT-29和LoVo细胞株各条带光密度值，并计算出两种细胞在各组中的平均光密度比值，进行半定量分析及统计学分析，并以各实验分组为横坐标，将测出相应的平均光密度比值为纵坐标绘出柱状图后发现0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷作用后，HT-29细胞株中MLH-1蛋白表达水平较对照组上调，并且呈时间、药物浓度依赖性(F=225.142,P=0.000)，与对照组DMSO组比较0.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组、1.0 μmol/L5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异(P<0.05)；LoVo细胞株中MLH-1蛋白表达水平较对照组上调，并且也呈时间、药物浓度依赖性(F=75.807,P=0.000)，与对照组DMSO组比较1.0 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异(P<0.05，表3、图2)。

A：DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组(左→右)中HT-29细胞株MLH-1蛋白Westernblot条带图；B：DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组中HT-29细胞株MLH-1蛋白柱状图；C：DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组(左→右)中LoVo细胞株MLH-1蛋白Westernblot条带图；D：DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组中LoVo细胞株MLH-1蛋白柱状图

3 讨论

CRC是最常见的消化道恶性肿瘤之一，每年全球新发病例达123万，病死率约为发病率的1/2。我国CRC发病率虽低于西方发达国家，但近20年来CRC的发病率仍在逐渐上升，同时，其发病年龄有增高趋势。近年研究表明CRC的发病是多因素、多阶段、多基因连续累积发生的过程，除遗传学改变外，表观遗传学改变亦参与CRC的发生、发展过程。表观遗传学是指不涉及DNA序列改变，但基因表达却发生可遗传的改变，DNA甲基化、组蛋白修饰、MicroRNA等是表观遗传学的主要形式。与肿瘤发生关系最密切的是DNA甲基化修饰异常，其中包括基因组去甲基化及部分区域高度甲基化两种形式。DNA甲基化可以导致癌相关基因沉默，病变迅速进展为癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能认识CRC中基因异常DNA甲基化，将可能获得CRC诊断的肿瘤标记物及新的治疗靶点[8-10]。

表3 HT-29和LoVo细胞株中MLH-1蛋白表达状况

本实验研究中我们采用去甲基化药物5′-氮杂-2′-脱氧胞苷处理两个结直肠癌细胞株：MSS细胞株HT-29和MSI细胞株LoVo后通过实时荧光定量PCR检测结果显示DNA水平上DMSO溶剂对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组中HT-29和LoVo细胞株中MLH-1基因甲基化状态分别都为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，表明去甲基化药物5′-氮杂-2′-脱氧胞苷能够逆转MLH-1基因甲基化状态。mRNA水平研究结果发现在应用0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷作用后，HT-29细胞株中MLH-1基因的mRNA表达水平较对照组上调，并且呈时间、药物浓度依赖性，与对照组DMSO组比较1.0 μmol/L和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异；同样，LoVo细胞株中MLH-1基因的mRNA表达水平较对照组也上调，并且也呈时间、药物浓度依赖性，与对照组DMSO组比较1.0 μmol/L和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异；最后通过Western blot检测结果发现在应用0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷作用HT-29和LoVo细胞株后，MLH-1蛋白表达水平均较对照组表达上调，并且均呈时间、药物浓度依赖性，进一步分析显示与对照组DMSO组比较，0.5 μmol/L、1.0 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异；LoVo细胞株中1.0 μmol/L和1.5 μmol/L 5′-氮杂-2′-脱氧胞苷实验组有统计学差异。

本实验研究显示甲基化酶抑制剂5′-氮杂-2′-脱氧胞苷可通过启动子甲基化而失活的MLH-1基因的异常甲基化状态得到逆转，而使该抑癌基因恢复其转录活性，以使该基因在肿瘤的发生发展中发挥可能的抑制肿瘤的作用。肿瘤的发生发展涉及多种途径和多种基因的改变，其中表观遗传学的变化逐渐受到医学研究的重视。异常甲基化是表观遗传学研究的一个重要内容，往往是导致抑癌基因失活的主要原因。我们希望能通过对异常甲基化的进一步研究，来寻求结直肠肿瘤诊断的新标记物和治疗的新靶点。

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