茶多糖对实验小鼠B16F10细胞瘤治疗效应的机制研究

陈美周，余方流，董 群

(皖南医学院 微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

黑色素瘤(melanoma)恶性程度极高，占皮肤肿瘤死亡病例的绝大部分，多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜。黑色素瘤于19世纪初由Garswell命名，是当前严重危害人类健康的一大疾病，尤其在新西兰和澳大利亚地区增长速度极其迅速，每年发病率增长速度约4%左右[1-2]。由于黑色素瘤全身转移发生早，晚期往往失去手术机会，而化疗和放疗对身体的危害性和副作用大，故积极探索和寻找有效治疗方法是当今医学领域重要的研究课题。近年来大量药理和临床研究表明，一些植物多糖能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，增强抗肿瘤作用[3]，而茶多糖在治疗肿瘤方面研究鲜为少见。本研究旨在深入探讨茶多糖对实验性小鼠治疗肿瘤效应及相关机制，以期为日常生活或临床治疗合理应用茶多糖奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与动物 小鼠B16F10肿瘤细胞株和YAC-1细胞株由东南大学基础医学院窦骏教授馈赠。C57BL/6雌性小鼠，鼠龄6周，体质量12～14 g，购自扬州大学医学比较中心，动物合格证明：SCXK(苏) 2012-0004。

1.1.2 主要试剂和仪器 MTT:Sigma产品；DMSO:天津市化学试剂一厂(分析纯)；台盼蓝：sigma产品；RPMI 1640：Hyclone 产品；小牛血清：杭州四季春产品；IFN-γ和IL-4检测试剂盒：武汉贝茵莱生物科技有限公司产品；CO2恒温培养箱：Thermo公司产品；酶标仪：普朗DNM-9602；生物安全柜：Esco产品。

1.1.3 实验药物 茶多糖购自上海耐今实业有限公司(D601025)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠黑色素瘤模型建立 取对数生长期的B16F10肿瘤细胞株，调整细胞浓度为1×106个/ml，每只注射0.2 ml，观察并记录小鼠肿瘤生长情况。

1.2.2 分组实验 C57BL/6雌性小鼠适应性培养1周，随机分成4组，茶多糖(tea polysaccharide，TPS)高剂量组(800 mg/kg)、TPS中剂量组(400 mg/kg)、TPS低剂量组(200 mg/kg)及生理盐水(NS)对照组。小鼠黑色素瘤模型建立后即对各组小鼠灌胃用药，对照组灌胃同等体积的NS，持续灌服28 d，最终摘眼球处死小鼠，留置血清，观察并记录实验小鼠体质量及肿瘤体积的变化等；计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤平均体积-实验组平均瘤体积)/对照组瘤平均体积×100%，瘤体积=π×(直径d/2)2。

1.3 NK活性的检测

1.3.1 效应细胞的制备 将小鼠颈椎脱位处死，酒精浸泡几分钟用酒精棉球消毒腹部，剪开腹部皮肤和腹膜，无菌取出脾脏和淋巴结，放入约有5 ml不完全1640的平皿中，用毛玻璃棒在无菌400目筛网研磨脾脏和淋巴结，将悬液细胞放入离心1次，1 000 r/min离心10 min左右，再用完全1640培养液重悬细胞，100倍稀释并用台盼蓝计数，调整活细胞浓度至1×107/ml，再用1640培养液调整至5×106/ml和2×106/ml，共3个浓度。

1.3.2 靶细胞的制备 取传代培养24～48 h对数生长期的YAC-1细胞，用RPMI不完全 1640 1 000 r/min离心10 min，再用完全1640培养液重悬细胞，100倍稀释并用台盼蓝计数，调整活细胞浓度至1×105/ml。

1.3.3 MTT法检测NK细胞的活性 96孔培养板中，试验孔加效、靶细胞各50 μl,效应细胞对照孔加效应细胞、培养液各50 μl，靶细胞对照孔加靶细胞、培养液各50 μl,每个标本做3个复孔，其效靶比分别为100∶1、50∶1、20∶1。将培养板放入CO2培养箱培养20h，然后各孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT再孵育4 h，孵育结束后各孔加入150 μl DMSO使其沉淀溶解，微型振荡器振荡10 min,在酶标仪上用波长490 nm对OD值进行检测。杀伤活性=[1-(实验组OD平均值-效应细胞组OD平均值)/靶细胞组OD平均值]×100%。

1.4 ELISA法检测IFN-γ和IL-4的分泌 具体操作步骤参照IFN-γ和IL-4检测试剂盒详细说明书，均购自于南京迪瑞生物技术有限公司。

2 结果

2.1 一般状况 实验前各组小鼠一般状况良好，建模后小鼠一般状况渐渐下降，进食量和饮水量逐渐减少，毛色逐渐变得干枯，有的还有脱毛现象。TPS治疗组延缓了小鼠体质量改变，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，以中剂量治疗组尤为明显(P<0.01)，见表1。

表1 各组实验小鼠治疗前后体质量变化(g,n=8)

2.2 瘤体积大小和抑瘤率 各组模型小鼠都长有一定大小的瘤块，其中NS对照组瘤块直径明显大于其他组，中剂量组瘤块直径明显小于其他组。治疗组各组小鼠瘤块直径与NS对照相比较皆有显著性差异(P<0.05)，以中剂量治疗组最为明显(P<0.01),其抑瘤率达到50.73%，见表2。

表2 各组实验小鼠肿瘤直径大小差异比较(n=8)

2.3 TPS对荷瘤小鼠NK细胞活性影响 无论何种效靶比的荷瘤小鼠，TPS都能明显提高NK效应细胞杀伤活性，NS对照组的活性是最低的，并随效靶比值变大而逐渐变小。其中任何一种效靶比，都是中剂量组NK细胞活性最高，且效靶比为20∶1时NK细胞活性最高，达39.06%，其活性也是随效靶比升高而逐渐变小。当效靶比为100∶1时，TPS治疗组杀伤活性与NS对照组比较没有统计学意义(P>0.05)，而中剂量组与对照组却有统计学差异(P<0.05)；当效靶比为10∶1时，治疗组各组活性均高于NS对照组，其比较却没有统计学意义(P>0.05)，中剂量组有差异(P<0.05)，但低剂量组NK细胞活性下降的幅度明显比高剂量组大；当效靶比为20∶1时，治疗组与对照组比较均有统计学差异(P<0.05)，其中中剂量组最为显著(P<0.01)，见表3。

表3 TPS对荷瘤小鼠NK细胞活性影响(%，n=8)

2.4 TPS对荷瘤小鼠IFN-γ和IL-4分泌水平的影响 TPS能提高IFN-γ分泌水平和降低IL-4分泌的水平。TPS治疗各组IFN-γ分泌水平都比NS对照组老鼠高，模型组IFN-γ分泌水平与对照组比较差异都有统计学意义(P<0.05)，且中剂量组与NS对照组比较差异有显著性统计学意义(P<0.01)，而中剂量组分泌水平为最高，达到841.90 ng/L；TPS治疗各组IL-4分泌水平都比NS对照组老鼠低，各组与其比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且中剂量治疗组与NS对照组比较有明显差异(P<0.01)，而中剂量组IL-4分泌水平为所有组中最低，其值为114.66，见表4。

表4 各组荷瘤小鼠IFN-γ和IL-4分泌水平的影响(n=8)

3 讨论

肿瘤是当前严重危害人类健康的一大疾病，积极探索有效预防与治疗肿瘤是当今医学领域重要的研究课题。通过合理饮食来预防肿瘤一直为众多学者密切关注。目前药物化疗仍然是治疗肿瘤的主要手段，但药物抗肿瘤往往会导致严重毒副作用。有研究表明，许多天然来源的多糖具有显著的抗肿瘤活性，比如香菇多糖[4-6]和黄芪多糖[7-8]在临床上已经开始作为治疗肿瘤新的药物。而TPS作为植物多糖在体内抗肿瘤活性尚不明了。茶叶中含有多种保健和药理活性成分,如茶多酚、TPS等[9]。近年来一些研究表明,茶多糖具有调节血糖、血脂,增强免疫及抗肿瘤等作用[10]，但很多研究大都只集中在体外实验。

本实验通过接种B16F10肿瘤细胞建立小鼠黑色素瘤模型，经TPS灌胃一段时间后，发现TPS能改善实验小鼠一般生存状况，主要表现为减缓小鼠体质量减轻程度，增加抑瘤率，经检测显示增强了小鼠NK细胞活性、增强IFN-γ及降低IL-4的分泌。NK细胞是机体非特异性免疫的关键细胞，尤其在抗肿瘤方面起着相当重要的作用。笔者以YAC-1细胞为小鼠NK细胞经典靶细胞，采用体内模拟方法检测小鼠NK细胞杀伤活性，经TPS治疗后，荷瘤小鼠NK细胞活性在效靶比为20∶1时均有所增强，尤其中剂量治疗组NK细胞活性最高，达39.06%。另外，实验还发现TPS治疗能增加IFN-γ和降低IL-4的产生。众所周知，IFN-γ作为抗肿瘤的重要免疫分子，也是衡量机体细胞免疫功能的指标分子，主要由活化的Th1细胞所分泌。而IL-4则主要由Th2细胞活化增殖产生的，其作用体现为增强特异性体液免疫且抑制Th1细胞的分化。因而IFN-γ/ IL-4的表达可作为机体特异性细胞免疫与体液免疫功能变化的“晴雨表”，笔者认为TPS可能通过增强了机体特异性细胞免疫功能而达到较好的抗肿瘤效果。总之，经本实验研究提示：TPS显示抗肿瘤效应，可能与增强免疫反应机制有关，不仅增强了非特性免疫，还诱导了特异性细胞免疫。

茶多糖在粗老茶叶中含量较为丰富，开发利用茶多糖，不仅能提高粗茶的经济价值，还能为临床上肿瘤治疗提供新的探索方向。而对于茶多糖抗肿瘤作用的具体机制还有待进一步深入研究。

【参考文献】

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[2] GELLER AC,CLAPP RW,SOBER AJ,etal.Melanoma epidemic：an analysis of six decades of data from the Connecticut Tumor Registry[J].J Clin Oncol,2013,31(33):4172-4179.

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