Notch信号在神经肽P物质对高氧暴露肺泡Ⅱ型 上皮细胞的保护作用机制

董欣鑫，姚 兰，方 芳，许 峰

(1. 重庆医科大学附属儿童医院PICU，儿童发育疾病研究省部共建教育部 重点实验室，重庆 400014；2. 太钢总医院，山西太原 030003)

慢性肺疾病(chronic lung disease, CLD)或支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是新生儿持续用氧治疗后的一种肺氧化性损伤疾病，严重影响患儿的肺发育和呼吸功能[1]。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ, AECⅡ)作为肺组织的干细胞，其增殖分化不仅可以修复肺泡的正常结构，而且可以有效改善肺功能。因此AECⅡ是决定肺损伤上皮细胞恢复正常功能状态的主要因素[2]。

神经肽P物质(substance P, SP)是一种细胞外信号分子和细胞调控因子，释放后可与神经激肽1受体(NK1R)结合，参与调控损伤细胞的修复、增殖、分化[3]。本课题组前期研究发现SP可减轻高氧致AECⅡ的凋亡，促进其增殖[4]，具有一定的保护效应。但其作用机制尚不清楚。研究表明Notch信号在肺发育中起重要作用，可能参与支气管树及气血屏障的形成，且对呼吸道上皮细胞、肺泡上皮细胞的成熟分化有重要调节作用[5]。因此，SP可能通过参与调节Notch信号的表达起到保护高氧肺损伤的作用。

本研究以原代培养的早产大鼠AECⅡ为研究对象，观察SP干预对高氧致AECⅡ细胞凋亡、氧化损伤、增殖及Notch1、Notch3表达的影响，拟探讨SP对高氧肺损伤细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂孕19 d Sprague-Dawley(SD)大鼠36只(清洁级成年孕鼠，体质量240～260 g，由重庆医科大学实验动物中心提供)；SP(美国Abcam公司)；SP拮抗剂L703.606、胶原酶、噻唑蓝(MTT)溶液(美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；超氧化物阴离子荧光探针检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；细胞AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；兔抗鼠Notch1及Notch3多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(美国CST公司)；BCA蛋白定量检测试剂盒(北京百泰克公司)，Trizol总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2早产大鼠AECⅡ的分离、培养及鉴定取孕19 d的大鼠，经剖宫产取出胎鼠，分离、纯化、培养AECⅡ，具体方法参考文献[6]。经透射电镜观察及改良巴氏染色法证实细胞存活率及纯度均在90%以上后备用。

1.3氧化损伤性细胞模型建立及实验分组原代AECⅡ经培养24 h后，随机分为以下4组：①空气组：将细胞置于含50 mL/L CO2的孵箱中培养；②高氧组：将细胞置于50 mL/L CO2、950 mL/L O2的密闭氧仓中；③高氧+SP组：细胞培养液中预先加入5×10-8mol/L的SP，再行高氧处理；④高氧+SP+ L703.606组：细胞培养液中预先加入5×10-8mol/L SP和5×10-7mol/L L703.606，其余处理同高氧组。各组细胞干预并培养24 h。

1.4AnnexinV/PI双标记法检测AECⅡ凋亡将原代培养的AECⅡ细胞接种于6孔板，调整密度为1×106个/mL，经分组处理后，胰酶消化并收集各种贴壁细胞，PBS清洗2次，重悬于结合液[10 mmol/L N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)/NaOH，pH 7.4，140 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L CaCl2]中，吹打成单细胞悬液，加入5 μL AnnexinV-FITC及10 μL PI于常温避光处孵育15 min，经流式细胞仪激发波长为488 nm处检测，FITC受激发后发出绿色荧光，PI发红色激光，凋亡细胞表现为FITC高染而PI低染(FITC+PI-)，计算出该区域的细胞比例。

1.5超氧化物阴离子含量的测定原代培养的AECⅡ细胞，以1×106个/mL 密度接种于细胞培养小室中，按上述分组处理24 h后，去除细胞培养液，加入1 μmol/L的Dihydroethidium(超氧化物阴离子荧光探针)溶液1 mL和细胞一起在37 ℃孵育30 min左右进行荧光探针装载，PBS液洗涤2次，在激发波长为535 nm，发射波长610 nm条件下，用微孔板检测系统(SpectraMax M5/M5e)检测各样本平均荧光强度(MFI)，用激光共聚焦显微镜观察图像并采集保存，统计学分析各荧光强度值。

1.6MTT法检测细胞存活率将原代分离的AECⅡ接种于96孔板，调整密度为1×104/mL，24 h后换液，按上述方法处理24 h后，加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，放入孵箱内继续孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜150 μL/孔，震荡10 min后，酶标仪检测492 nm处各孔吸光度值(A值)。细胞存活率=处理孔A492/对照孔A492×100%。

1.7荧光定量PCR检测Notch1和Notch3采用Trizol一步法提取AECⅡ的总RNA，测定吸光度A260/A280值，计算提取的总RNA浓度，逆转录合成cDNA。PCR引物由Primer premier 5.0自行设计。扩增Notch1基因正义链的引物序列：5′-TGGATGAGGAAGACAAGCATTA-3′，反义链序列为：5′-GAAAAGCCACCGAGATAGTCAG-3′，扩增片段为136 bp；扩增Notch3基因正义链的引物序列：5′-GACAAGGACCACTCCCACTACT-3′，反义链序列为：5′-ATCCACATCATCCTCACAACTG-3′，扩增片段为136 bp；GAPDH正义链的引物序列：5′-GCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′，反义链序列为：5′-TCACCCCATTTGATGTTAGCG-3′，扩增片段为106 bp。反应体系25 μL，反应条件：95 ℃变性30 s，Notch1、Notch3、GAPDH基因的退火温度分别为59 ℃、60 ℃、60 ℃，退火30 s，95 ℃延伸15 s，共40个循环。根据扩增曲线和溶解曲线检测反应的特殊性，结果以GAPDH标准化，应用CFX Manager软件计算目的基因的相对表达量。

1.8Westernblot检测Notch1、Notch3蛋白水平全蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白质30 μg上样，经100 g/L的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，含50 g/L的脱脂奶粉的TBST封闭后，分别加入Notch1多克隆抗体、Notch3多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，用ECL化学发光法检测，蛋白条带用Quantity One 4.5.0软件分析处理。

2 结 果

2.1高氧及SP干预对AECⅡ存活率和凋亡率的影响与空气组比较，高氧组暴露后24 h，细胞凋亡率显著升高，细胞存活率明显受到抑制(P<0.01，表1)。高氧+SP组可明显降低高氧暴露后细胞凋亡率，提高细胞存活率，与高氧组和高氧+SP+L703.606组相比差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1高氧暴露及SP干预对AECⅡ细胞存活及凋亡的影响

Tab.1 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on survival rate and apoptosis rate of AECⅡ

n=6)

与空气组比较，*P<0.01；与高氧+SP组比较，#P<0.01。

2.2高氧及SP干预对AECⅡ超氧化物阴离子水平的影响与空气组比较，高氧组暴露后24 h，细胞超氧化物阴离子水平显著升高(P<0.01)。高氧+SP组可明显降低高氧暴露后细胞的超氧化物阴离子水平，与高氧组及高氧+SP+L703.606组相比差异有统计学意义(P<0.01，图1)。

图1 高氧及SP干预对AECⅡ超氧化物阴离子荧光水平的影响Fig.1 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on the level of intracellular superoxide anion A:超氧化物阴离子荧光强度表达(×400);B:定量分析。1:空气组;2:高氧组;3:高氧+SP组;4:高氧+SP+L703.606组。与空气组比较,*P<0.01;与高氧组比较,#P<0.01;与高氧+SP组比较,&P<0.01。

2.3SP及高氧暴露对AECⅡ内Notch1、Notch3基因水平的影响与空气组比较，高氧组Notch1基因水平表达明显降低(P<0.01)，Notch3基因水平表达显著升高(P<0.01)，高氧+SP组与单纯高氧组比较，Notch1基因水平表达升高，Notch3基因水平表达降低，具有统计学意义(P<0.01，图2)。

图2SP及高氧暴露对AECⅡ内Notch1、Notch3基因水平的影响

Fig.2 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on the mRNA expression of Notch1 and Notch3 in AECⅡ

1：空气组；2：高氧组；3：高氧+SP组；4：高氧+SP+L703.606。与空气组比较，*P<0.01；与高氧组比较，#P<0.01；与高氧+SP组比较，&P<0.01。

2.4SP及高氧暴露对AECⅡ内Notch1、Notch3蛋白质水平的影响与空气组相比，高氧组Notch1蛋白水平表达明显降低(P<0.01)，Notch3蛋白水平表达显著升高(P<0.01)，高氧+SP组与单纯高氧组比较，Notch1蛋白水平表达升高，Notch3蛋白水平表达降低，具有统计学意义(P<0.01，图3)。

图3SP及高氧暴露对AECⅡ内Notch1、Notch3蛋白质水平的影响

Fig.3 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on the protein expression of Notch1 and Notch3 in AECⅡ

A：Western blot检测结果；B：半定量分析结果。1：空气组；2：高氧组；3：高氧+SP组；4：高氧+SP+L703.606组。与空气组比较，*P<0.01；与高氧组比较，#P<0.01；与高氧+SP组比较，&P<0.01。

3 讨 论

BPD是新生儿接受高浓度氧治疗的严重并发症之一[1]。主要原因是高浓度氧导致肺组织细胞的ROS产生增多，包括羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)等，过量的ROS可通过氧化应激反应诱导肺泡上皮细胞凋亡甚至坏死[7]。肺损伤的修复主要依赖于AECⅡ的增殖分化，而高氧刺激可抑制AECⅡ的增殖，促进其凋亡。因此寻找保护AECⅡ氧化损伤的因素，可为高氧肺损伤的防治提供理论基础。

SP作为一种感觉神经肽，具有修复细胞增殖、迁移、分化等多种生物学效应[3]。OSLUND等[8]发现通过活化NK1R有助于肺损伤后上皮细胞增殖，是参与损伤修复的重要因素。DIB等[9]发现神经肽递质能通过激活NK1R起到保护急性高氧肺损伤的作用。本实验室黄波等[4]发现SP对高氧状态下AECⅡ的损伤有明显保护作用，但其作用机制尚不清楚。本研究结果显示，SP干预后可减轻氧化损伤，降低细胞凋亡率，增加细胞增殖活性，此结果同前期结果[4]一致。SP的拮抗剂L703.606干预后细胞内超氧化物阴离子水平、细胞凋亡率较SP干预后明显增加，细胞增殖率明显降低，进一步支持SP可以减轻AECⅡ的氧化损伤，促进细胞增殖。

为研究SP作用所涉及的分子机制，本研究对高氧及SP干预下Notch信号通路的活化情况做了进一步的观察。Notch信号途径广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物并且高度保守，是胚胎发育所必需的细胞间调节信号，由Notch1～4、配体(Delta、Jagged)及目的基因Su(H)、Hes组成，通过Notch受体和配体相互作用，发生2次裂解后形成活化的胞内区，进而与胞质和胞核内的相关蛋白结合来调控Su(H)、Hes基因的转录，最终影响多种细胞增殖、分化、发育[10]。近年来研究表明Notch信号可能在调控肺泡上皮细胞的分化发育中起重要作用[11]。TAICHMA等[12]发现Notch 1及Jagged 1在肺泡微血管内皮细胞膜表面定位表达。XING等[13]发现Notch1在气道损伤修复中起关键作用。DANG等[14]在活化 Notch3转基因小鼠中发现大量的I型上皮细胞，可见Notch3的持续异位表达影响了上皮细胞的正常分化，最终造成肺形态学改变及发育延迟。

本研究以高氧暴露损伤AECⅡ模型作为研究对象，对Notch1和Notch3的表达进行了研究。结果显示，高氧暴露下AECⅡ内Notch1信号分子表达明显减弱，Notch3信号分子表达明显增加，与空气组比较差异有统计学意义。而高氧暴露前给予SP干预后，Notch1表达有所增加，Notch3表达有所降低，表明SP可逆转高氧对Notch信号分子的作用。研究表明，Notch1的活性增加后，与相关配体结合，进而引起目的基因Su(H)、Hes的转录表达，细胞进入增殖分化程序，发育成功能细胞[10]。因此，推测高氧暴露前给予SP干预后，Notchl表达的上调是促进AECⅡ分化增殖的主要机制之一，有助于高氧损伤上皮细胞的修复。Notch3活性上调可能通过抑制Notch1信号分子的表达，阻止 AECⅡ分化，两者间存在一个制约关系。因此，Notch3的活化是高氧阻滞AECⅡ分化增殖的重要因素，对高氧引起的AECⅡ损伤修复起负面作用，而给予SP干预后可解除这一作用，从而促进高氧损伤AECⅡ的存活。

综上所述，SP可能通过Notch通路的介导，减轻了高氧对AECⅡ的氧化损伤，降低了AECⅡ的凋亡，促进AECⅡ的增殖，利于肺损伤的修复，为BPD的防治提供了新的方向。

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