脑胶质瘤中miR-7与EGFR/PI3K信号通路相关基因蛋白表达的关系

刘亮洪，张洪云，刘晓智，张立东，姜忠敏

(1天津港口医院，天津塘沽300456;2天津市第五中心医院)

胶质瘤的发生、发展本质上是多种基因共同作用致使基因表达失衡的结果，而基因表达受基因水平、转录水平、转录后水平及蛋白水平等多层面的调控，其中微小RNA(miRNA)在转录后水平对基因表达的精细调控近年来倍受关注。miRNA是一类大小约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与信使RNA(mRNA)的3'端非翻译区(3'UTR)完全或不完全互补结合降解靶mRNA或抑制其翻译，对其表达水平进行转录后调控，在肿瘤的形成过程中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用［1，2］。我们在前期工作中发现，在胶质瘤细胞系中转染miR-7后抑制了肿瘤的生长，但具体机制尚不清楚。2009年1月～2013年12月，我们观察了脑胶质瘤组织、U251细胞中miR-7、EGFR/PI3K信号通路相关(EGFR、PI3K和AKT2)基因蛋白的表达，并探讨其关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择天津市第五中心医院和港口医院神经外科收治的脑胶质瘤患者42例，手术切除肿瘤组织，其中8例选取瘤旁正常脑组织。42例胶质瘤患者按照WHO 2007年脑肿瘤分类标准分类:Ⅰ级6例，Ⅱ级16例，Ⅲ级9例，Ⅳ级11例。脑胶质瘤组织及正常脑组织均分为两部分，一部分经甲醛固定后制作成蜡块进行免疫组化染色;另一部分贮存于液氮，用于提取总RNA。U251胶质瘤细胞由天津医科大学总医院神经疾病研究所馈赠。

1.2 细胞培养与质粒转染 细胞培养:U251胶质瘤细胞在37℃、5%CO2饱和湿度于含10%胎牛血清的DMEM中培养。隔天换液，每3 d传代1次。实验分组:①空白对照组，仅加入脂质体;②无义序列组，加入无义序列和脂质体;③miR-7转染组:miR-7序列为5'-UUGUUUUAGUGAUCAAGAAGGU-3'。质粒转染:细胞生长至60% ～70%汇合时，降低血清浓度至5%，然后将1 μg的质粒与100 μL的LipoVecTM混合20 min后加入培养基中，4 h后换成含20%血清的培养基继续培养。转染48 h后，用含200 ng/L G418的培养基进行筛选，每3 d更换选择培养液1次。14 d后细胞集落形成，未转染组细胞死亡。待阳性细胞生长至一定数量时，用24孔板进行细胞克隆与传代扩增。

1.3 脑胶质瘤组织、U251细胞中miR-7检测 采用RT-PCR法。在冰冻胶质瘤组织和空白对照组、无义序列组、miR-7转染组细胞中利用TRIzol一步法提取总RNA;反转录后进行PCR循环反应。miR-7上游引物:5'-AAAAAGAACACGTGGAAGGATAG-3'，下游引物:5'-CCGCCTAACGTACCGCGAATTT-3'。反应条件:94℃、3 min后连续45个循环，每个循环内 94 ℃、30 s，60 ℃、45 s，72 ℃、30 s。以人18 rRNATaqman探针作为内参。目的基因mRNA相对表达量=目的条带的灰度值/同一标本内参的灰度值。

1.4 脑胶质瘤组织中EGFR、PI3K和AKT2蛋白检测 采用Envison两步法。选取石蜡组织块，连续切片，厚4 μm，常规HE染色及免疫组化染色。免疫组化染色步骤按试剂盒说明书操作进行。每次实验均设立相应的阳性对照，PBS液代替一抗作为空白对照。

1.5 U251 细胞中 EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 和蛋白检测 将转染miR-7后的U251细胞、无义序列组及空白对照组分别提取RNA和蛋白，用RT-PCR检测EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表达，方法如下:采用TRIzol一步法提取总RNA，然后利用RT-PCR试剂盒，按说明书详细步骤进行。采用Western blotting法检测 EGFR、PI3K、AKT2蛋白表达，方法如下:U251细胞转染miR-7后提取总蛋白，Bradford法蛋白定量。电泳后考马斯亮蓝染色，蛋白分离满意后转膜，Western封闭液37℃封闭2 h，PBS充分漂洗后滴加相应一抗，抗体稀释度分别为EGFR(1∶500)、PI3K(1∶500)和AKT2(1∶1 000)，4 ℃水平摇床过夜，次日使用辣根酶标记的1∶500稀释二抗37℃、2 h。化学发光试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统扫描光密度值，Quantity One软件分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用ANOVA单因素方差分析，组间多重比较采用q检验;计数资料采用例(%)表示，组间比较采用χ2检验;miR-7与EGFR/PI3K信号转导通路成员之间的相关性用Spearman等级相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤组织中miR-7、EGFR/PI3K信号通路相关蛋白表达的关系 miR-7在脑胶质瘤和正常脑组织中的分别为 1.47±0.27、3.47±0.15，二者比较，P＜0.05。miR-7在WHOⅠ～Ⅳ级胶质瘤组织中分别为 2.12± 0.24、1.97± 0.20、0.96± 0.15、0.55±0.13，Ⅰ、Ⅱ级比较无统计学差异，其余两两比较均有统计学差异(P均＜0.05)。

EGFR、PI3K和AKT2在脑胶质瘤中的着色部位均定位在细胞膜或细胞质。随着胶质瘤WHO级别的增加，EGFR、PI3K和AKT2表达均有不同程度的增加，且差异有统计学意义(P＜0.05)。miR-7与EGFR、PI3K、pAKT在脑胶质瘤组织中的表达呈负相关(r分别为 －0.754、－0.528、－0.467，P 均 ＜0.05)。

2.2 U251细胞中miR-7、EGFR/PI3K信号通路相关基因蛋白表达的关系 miR-7转染组与空白对照组、无义序列组比较，EGFR、PI3K和AKT2的表达均明显增加(P均＜0.05)。结果见表1。

表1 U251细胞中miR-7、EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表达水平(±s)

表1 U251细胞中miR-7、EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表达水平(±s)

注:与空白对照组、无义序列组比较，*P＜0.05

组别miR-7 mRNA EGFR mRNA PI3K mRNAAKT2 mRNA miR-7 转染组 2.36±0.18*0.81±0.09*1.01±0.12Δ*0.99±0.10*空白对照组 0.54±0.09 2.11±0.11 1.98±0.10 1.74±0.14无义序列组0.68±0.12 2.27±0.13 1.93±0.13 1.71±0.15

3 讨论

研究［3，4］表明，胶质瘤的发生、发展与多条基因通路表达失控密切相关，调控基因通路表达的因子众多，其中miRNA在转录后水平对某些基因通路表达的精细调控近年来倍受关注。研究［5］表明，在胶质瘤细胞中有多种miRNA的表达存在差异，其中miR-7是差异最显著者之一。Kefas等［6］首先报道在胶质瘤细胞中出现miR-7低表达及其可能充当抑癌基因角色。本课题组的前期研究［7］发现，转染miR-7的胶质瘤细胞其增殖细胞周期及细胞迁移能力受到明显抑制。本研究发现，随着胶质瘤级别的增高，miR-7的表达呈显著降低趋势，该结果提示miR-7表达减少或缺失可能是胶质瘤发生、发展过程中的重要分子事件。

EGFR是一种跨细胞膜糖蛋白，是酪氨酸激酶受体erbB家族成员。EGFR与配体结合后，受体酪氨酸激酶自磷酸化，激活下游信号通路，调控细胞增殖、分化。该因子突变、扩增与过表达是恶性胶质瘤尤其是原发性胶质母细胞瘤早期和主要的分子事件，它通过下游通路成员推进肿瘤细胞的细胞周期、抑制细胞凋亡、加强端粒酶活性、促进肿瘤血管生成和肿瘤侵袭［8］。活化的EGFR主要通过两条信号转导途径将信息转至细胞核，一条是ras-raf-MEK-Erk/MAPK途径，信号经Shc、Grb2传递，最后经c-jun、cfos传到核内;另一条是PI3K-AKT途径，导致NF-κB移位至核内，这种信号转导的级联反应引起核内效应基因，特别是细胞周期调控元件的激活和转录，调控细胞生长［9］。

Wang等［10］研究报道miR-7的基因序列与EGFR基因3'-UTR区存在至少3个区域的不完全互补，同时与EGFR通路成员AKT-2的上游调节因子IRS-1和IRS-2的3'-UTR区存在数个片段的不完全互补，通过抑制EGFR和AKT-2的蛋白质表达，实现了对胶质母细胞瘤的增殖抑制作用。我们前期工作发现转染miR-7可有效逆转其恶性表型，本实验对其调节机制做了进一步研究，发现转染miR-7的胶质瘤细胞EGFR/PI3K通路主要成员的表达受到了明显的抑制。另外我们又在脑胶质瘤标本中检测miR-7和EGFR/PI3K通路主要成员(EGFR、PI3K、AKT)的表达情况发现，随着WHO级别的增加miR-7表达呈显著下降趋势，而EGFR、PI3K、AKT表达则显著增加，三者与miR-7表达呈显著负相关，该结果与在胶质瘤细胞系中的研究结论基本一致，说明EGFR/PI3K通路可能是miR-7调控胶质瘤发生发展的重要机制之一。

应用抗人EGFR单克隆抗体靶向EGFR信号通路治疗恶性肿瘤已经成为肿瘤综合治疗新的途径和热点。随着对miR-7功能研究的不断深入，越来越多的证据表明miR-7可能通过不同的途径激活EGFR信号通路而调控胶质瘤的发生、发展;miR-7可能成为人脑胶质瘤靶向治疗的一个新的研究靶点。

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